銀杏提取物中銀杏酚酸類物質的毒性和藥理活性研究進展*

李 顏，郭 澄

（上海市第六人民醫院藥劑科，上海 200233）

銀杏Ginkgo biloba L. 屬裸子植物銀杏門唯一現存物種，被譽為植物界的“活化石”，原產于我國，現廣泛種植于全世界。銀杏始載于《神農本草經》，但對銀杏（白果）、銀杏葉藥用價值的記載始于宋代。元代醫家李杲在《食物本草》中最早記載了銀杏的毒性和解毒方法，“小兒食之，發驚，多食，立死”“連飲冷白酒幾盞，吐出則生”。后世歷代醫家多認為銀杏有毒或小毒[1]。現代的植物化學研究已從銀杏葉中發現160 多種化合物，主要為銀杏黃酮類、銀杏內酯類和銀杏酚酸（GA）類成分[2－3]。近年來的研究顯示，銀杏葉中藥制劑對冠心病、心絞痛、大腦退行性病變及心血管疾病引起的腦功能障礙、老年癡呆等療效確切，銀杏黃酮類和銀杏內酯類是其臨床療效的物質基礎。其中，GA 類成分一直被認為是引起臨床不良反應的主要物質，有致敏性和致突變毒性，故GA 類的限量是評價銀杏葉制劑質量的指標之一，但同時GA 類成分也具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等生物活性[4]。現就近年來對GA 的研究進行綜述，為其全面、合理地開發和利用提供參考，也提醒審慎思考銀杏制劑臨床使用中出現不良事件的原因。

1 毒性

1.1 致敏、致突變毒性

1998 年，HAUSEN[5]研究了銀杏酸類對豚鼠的過敏反應，結果表明，純酚酸物質可引起過敏，但銀杏葉提取物未引起豚鼠過敏。BERG 等[6]對雄性中國倉鼠肺成纖維細胞的黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT）的分析結果顯示，3 個主要的GA（13 ∶0，15 ∶1，17 ∶1）無誘變的致突變性效力。

1.2 肝毒性

LIU 等[7]通過大鼠原代肝細胞和HepG2 細胞系模型研究Ⅰ相代謝酶對GA（15 ∶1）毒性的影響，結果發現GA（15 ∶1）對被CYP1A 和CYP3A 代謝后的代謝產物具有更強的細胞毒性。JIANG 等[8]以代謝組學方法結合生化測定研究，結果表明，GA（15 ∶1）可影響模型小鼠肝臟的氧化應激和嘌呤代謝水平，且具有劑量依賴性。YAO 等[9]的研究結果顯示，參與GA（17 ∶1）的藥物代謝酶為CYP1A2，CYP3A4，UGT1A6，UGT1A9，UGT2B15；從MMT 實驗結果看，GA（17 ∶1）對HepG2 細胞的毒性作用呈時間和濃度依賴性，但對原代肝細胞的毒性低于HepG2 細胞，同時也表明CYP1A－和CYP3A 介導的代謝增加了GA（17 ∶1）的毒性。

1.3 其他

德國學者分別在2001 年和2002 年研究了銀杏提取物的神經毒性作用，結果顯示，GA 濃度依賴性地誘導雞胚胎體外培養的神經細胞死亡，表現為染色質濃縮、核縮和蛋白質合成抑制劑放線菌酮損失減少，提示細胞死亡，可能的原因是激活蛋白磷酸酶type－2C[10－11]。HECKER 等[12]研究了GA 對人角質形成細胞系HaCaT和恒河猴腎小管上皮細胞系LLC－MK2 的影響，結果顯示，GA 可能抑制溶酶體酶的形成，誘導乳酸脫氫酶的釋放，從而引起HaCaT 細胞凋亡。BERG 等[6]采用雄性中國倉鼠肺成纖維細胞（V79）評價3 個主要GA 成分（13 ∶0，15 ∶1，17 ∶1）的細胞毒性，結果顯示，24 h 內在高于50 mmol／L 濃度條件下孵化時，細胞毒性與濃度呈依賴關系。YAO 等[13]研究了GA（15 ∶1）對MDCK 細胞的致壞死作用及可能的機制，發現GA（15 ∶1）誘導細胞周期停滯在G0／G1和G2／M 期，影響DNA 合成和細胞有絲分裂，最終誘發腎毒性。RYCKEWAERT 等[14]通過體外實驗和計算方法對GA 的毒性機制進行研究，結果顯示，GA 能調節SIRT 活性，其特異性抑制譜和細胞毒與非特異性抑制劑（SIRT1 和SIRT2）相當，且不同于SIRT1 特異性抑制劑EX－527，非特異性SIRT 抑制被認為是其體外細胞毒性的新機制。

2 藥理活性

2.1 抗腫瘤

不同學者對GA 在抑制腫瘤方面進行了體外研究，包括肺癌、結腸癌、肝癌、胃癌和腎癌。研究結果發現，GA 可通過調節不同的信號通路影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。

上皮間質轉化（EMT）是腫瘤細胞轉移的關鍵環節。BAEK 等[15]研究發現，GA（15 ∶1）可抑制A549 和H1299肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。其抑制了EMT 相關基因[牽連蛋白、波形蛋白、N－鈣黏蛋白(N－cadherin)，基質金屬蛋白酶(MMP)－9，MMP－2，Twist，Snail]的表達，并抑制了轉化生長因子－β(TGF－β)誘導的EMT，但不影響A549 和H1299 細胞中各種上皮標記蛋白（Occludin 和E－cadherin）的表達。這些研究表明，GA（15 ∶1）通過抑制PI3K／Akt／mTOR 信號通路來抑制肺癌的侵襲和遷移，并為控制腫瘤細胞的轉移、擴散提供潛在的治療性化合物來源。信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）是致癌轉錄因子，可調節涉及多種血液惡性腫瘤包括多發性骨髓的進展。BAEK 等[16]的研究顯示，GA（17 ∶1）表現出減弱STAT3 激活的作用，表明其在癌癥中有潛在的治療作用。QIAO 等[17]的研究結果表明，GA可減少SW480 結腸癌細胞增殖，并抑制遷移，且呈濃度依賴性。進一步研究發現，GA 通過誘導腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)激活和抑制侵襲相關蛋白的表達來實現。LIU 等[18]研究發現，GA 對結腸癌細胞的增殖、遷徙和入侵有抑制作用，GA 可引起腫瘤細胞G0／G1期阻滯并引發內源性細胞凋亡和ROS 調節的自噬，認為GA 可作為治療結腸癌的潛在藥物。LI 等[19]的研究結果顯示，GA可抑制侵襲相關分子（MMP－2 和MMP－9）的表達，同時抑制HepG2 細胞EMT，進一步深入研究發現，其作用機制為下調HGF／c－Met 信號通路。LORENTE 等[20]的研究結果顯示，GA 作為一種SUMO 蛋白修飾抑制劑，通過增加TRIB3 的表達和減少SUMO1 復合物的形成誘導自噬介導的腫瘤細胞死亡，從而達到抑制腫瘤細胞的作用。LIANG 等[21]研究發現，GA 可通過誘導細胞凋亡和抑制活性氧簇(ROS)調控的STAT3／JAK2 信號轉導抑制胃癌細胞的生長。ZHU 等[22]研究發現，在體內外GA均 可 通 過 影 響 腎 細 胞 癌(RCC) 細 胞（786－O 和A498）G1期阻滯其活性和增殖。GA 還可減少RCC 細胞的侵襲和遷移。表皮生長因子受體（EGFR）是GA 的重要靶蛋白，GA 可顯著抑制腎癌的EGFR 的信號傳導，從而發揮其抗腎癌的作用。

2.2 抗炎殺菌

腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染是世界性難題，目前尚無有效治療方法。生物膜的形成與EHEC 感染密切相關，也是抗藥性的機制。LEE 等[23]研究發現，5 μg／mL 的GA（15 ∶1，17 ∶1）及100 μg／mL 的銀杏葉提取物在聚苯乙烯和玻璃表面，以及尼龍膜上均能抑制EHEC 生物膜的形成；轉錄分析結果表明，GA（15 ∶1）抑制了EHEC中的curli 基因和prohage 基因表達；此外，還發現GA和銀杏葉提取物可抑制3 種金黃色葡萄球菌菌株生物膜的形成。該研究結果表明，植物次生代謝產物GA 是生物膜抑制劑的重要資源。HUA 等[24]使用綠色熒光蛋白（GFP）標記的細胞株研究了GA（15 ∶1）的抗菌活性及其潛在作用機制，推測GA（15 ∶1）是通過抑制解淀粉芽孢桿菌的蛋白質活性達到抗菌作用；同時發現，革蘭陰性細菌細胞壁中某些成分可攔截GA（15 ∶1）大量滲透，這也是其對革蘭陰性菌無明顯抗菌作用的主要原因之一。LI 等[25]研究了GA 對氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）引起的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)氧化的緩和作用，并明確了其分子機制，結果表明，GA 的抗炎特征是通過抑制NF－κB 通路減低誘導型一氧化氮(iNOS)和環氧合酶2(COX－2)并激發細胞因子實現的。GERSTMEIER 等[26]研究了GA 對脂質介質（LMs）生物合成的影響，結果發現，GA 在基于mPGES 的藥效虛擬篩選和細菌刺激人M1 和M2 樣巨噬細胞的實驗中表現為促炎性LMs 生物合成酶的有效多靶點抑制劑，該結果有助于解釋GA 復雜的藥理作用和毒理學特征。ZHANG 等[27]研究了GA 抗ox－LDL 誘導的人微血管內皮細胞（HMEC－1）和人外周單個核細胞（nPBMCs）的氧化和炎性反應，結果表明，GA 可提高ox－LDL 處理后的細胞活性，且顯著降低細胞內的ROS 和促炎性細胞因子，進一步發現GA 通過NF－κB 途徑發揮抗炎作用。

2.3 神經保護

銀杏葉標準提取物EGb761 被用于治療阿爾茨海默病所致記憶力下降、精神分裂癥、癡呆癥等神經和精神方面的疾病。GA 對記憶力的影響目前仍未知。MANGO 等[28]通過電生理分析了GA 對海馬長時程增強和突觸傳遞的影響，發現GA 對Aβ 引起的神經遞質損傷釋放和突觸可塑性具有神經保護作用。α－突觸核蛋白（αsyn）集聚而成的胞漿內涵體（Lewy bodies）的積聚是帕金森病的主要病理特征，也能引起多巴胺能神經元變性。VIJAYAKUMARAN 等[29]在SH－SY5Y 神經母細胞瘤細胞和大鼠原代皮層神經細胞上觀察了GA 對α－syn聚集體清除率的影響，結果顯示，GA 能促進α－syn 聚集體的自噬性清除，提示可能在疾病治療中具有潛在作用。

2.4 抗寄生蟲

隱孢子蟲是一種原生動物寄生蟲，能引起免疫缺陷性腹瀉和免疫功能低下性危及生命的腹瀉。WU 等[30]通過體外細胞研究發現，GA 類物質對人腺癌（HCT－8）細胞株中隱孢子蟲活性有一定的抑制作用，5.0 μg／mL 的GA 作用48 h 后培養基中隱孢子蟲的數量明顯減少，提示GA 可作為治療隱孢子蟲疾病的潛在候選藥物。CHIDIEBERE 等[31]研究了GA（15 ∶1）在HCT－8 細胞株中抗隱孢子蟲的活性，以NTZ（Nitazoxanide）作陽性對照藥物，研究發現，GA 單體碳鏈的長度是影響抗隱孢子蟲活性的重要因素，推測較長的烷基鏈有更高的膜滲透性，從而使藥物運輸更有效。

2.5 治療糖尿病

YOON 等[32]利用C2C12 肌肉細胞和3T3－L1 前脂肪細胞篩選了658 種天然化合物對破壞胰島素信號通路的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的影響，結果顯示，GA 作為PTPN9 和DUSP9 的雙重靶向抑制劑，可通過激活AMPK 信號傳導增加3T2L1 和C2C12 細胞的葡萄糖攝取，提示GA 可作為治療2 型糖尿病的候選藥物。

2.6 抗氧化

泛素化作用于老化／氧化應激中下游環節。CHHUNCHHA等[33]研究發現，GA 可全面抑制晶狀體上皮細胞中的異常類泛素化而減輕氧化應激，并明確了其作用機制是通過改變Sp1／Prdx6 的失調來實現的。

2.7 其他

甘氨酸受體（GlyRs）屬五聚體環受體操作通道的超家族，參與許多生理功能，包括運動、視覺和疼痛。MALEEVA 等[34]通過CHO－K1 和N2a 細胞研究了銀杏酚酸對甘氨酸受體的作用，結果顯示，GA 是α1GlyRs的新型選擇性增強劑[34]。LIU 等[35]研究發現，作為泛素化的抑制劑，GA 在間充質干細胞分化（MSCs）中有一定活性，在經過GA 預處理的小鼠骨髓基質細胞分化中能增強成脂前基因的表達，且在成脂培養基中培養后分化為脂肪細胞的效率更高；但在脂肪細胞形成后期添加GA 時，脂肪細胞的成熟明顯受到抑制，同時多個脂肪生成基因的表達顯著下調，提示了GA 在細胞治療方面的潛能。BORENSTEIN 等[36]研究了GA 在體外通過抑制融合蛋白和病毒蛋白抑制單純皰疹病毒1 型（HSV－1）的合成，顯示出對GA 非包膜腺病毒也有抑制作用；同時，在感染后給予GA 同樣可抑制HSV－1 和CMV 的復制，表明GA 具有靶向蛋白質和DNA 合成的二級機制。鑒于GA 對病毒感染的有效作用，即使在感染開始后，也可用于急性感染（如感染新型冠狀病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒）和用于一些病毒的積極治療（如HSV－1、HSV－2、水痘帶狀皰疹病毒）。

3 思考

銀杏制劑臨床使用的安全性是藥學工作者關注的重點。GA 具有致敏性和致突變毒性，GA 的限量也是評價銀杏制劑質量的關鍵指標之一。1997 年，德國衛生部規定銀杏葉制劑中GA 含量應低于5 μg／g；《中國藥典》自2010 年版起規定銀杏葉提取物中總酚酸不得超過10 μg／g。GA 是一組混合物，包括5 種成分，即銀杏新酸（13 ∶0）、銀杏酸（15 ∶1）、十七烷二烯銀杏酸（17 ∶2）、氫化銀杏酸（15 ∶0）和十七烷二烯銀杏酸（17 ∶1）。其中，銀杏新酸（13 ∶0）、銀杏酸（15 ∶1）和十七烷二烯銀杏酸（17 ∶1）占總酚酸的90%[3]。但對GA 的毒性研究仍集中在體外的細胞毒性研究，對制劑中GA 引起人體的毒性損傷尚未見報道。銀杏制劑臨床需長期服用，GA 的體內代謝情況及是否有蓄積性毒性的研究報道也缺乏。此外，對GA 藥理活性研究是目前研究的熱點，特別是其抗腫瘤作用的研究。研究結果提示，GA 可作為潛在的抗腫瘤藥物，同樣是體外細胞藥理學的研究結果，全面、合理地開發和利用GA 類制劑需做進一步的體內和臨床研究。

GA 的研究文獻分析，結合回顧性的臨床試驗分析[37]提示，對銀杏提取物制劑致臨床不良事件原因的思考除制劑所含成分外，還需考慮患者聯合用藥時發生的藥物相互作用。銀杏內酯A 和B 能促進肝代謝酶CYP3A4轉錄和蛋白表達，并增加其對底物的代謝能力，黃酮類成分（槲皮素和山柰酚）可抑制CYP3A4 活性，尤其是抑制體內硝苯地平的代謝，且隨著黃酮攝入的增加，其程度進一步加強，導致不良反應（頭痛、頭暈、心率加快、虹膜出血）的發生[38]。也有學者發現，銀杏對CYP2C19 有明顯的誘導作用，可提高奧美拉唑代謝物的血藥濃度，但未見其引發不良事件的報道[39]。由于銀杏類制劑并非CYP 家族的強誘導或強抑制類制劑，根據已有文獻和臨床觀察，對硝苯地平等藥物合用引發的不良反應需重點關注[38]。