γδT17 細(xì)胞遷移在惡黑發(fā)病中的作用

孟祥慧 初金玉 王九妹 馬志紅 馬紅艷

【摘要】惡性黑色素瘤（Malignant Melanoma，MM）是由突變的黑色素細(xì)胞大量增殖而引起的一種惡性腫瘤。而其發(fā)病率約占到人體全身惡性腫瘤的 4%～5%。近幾年調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，惡黑正以每年 3%～5%的速度在逐年遞增，不容小覷。臨床上可通過各種途徑來診治惡性黑色素瘤，但目前最有效的方法還是早期診斷以及早期手術(shù)擴(kuò)大切除、淋巴結(jié)清掃。然而，相當(dāng)一部分黑色素瘤患者仍發(fā)生了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良，五年生存率約為 20%。到目前為止，導(dǎo)致黑色素瘤發(fā)生的確切的分子機(jī)制，尤其是分子轉(zhuǎn)移機(jī)制在很大程度上仍然是未知的。腫瘤的免疫調(diào)控和免疫治療是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但學(xué)者們對MM 的免疫機(jī)制研究仍較少涉及。有研究發(fā)現(xiàn)，在惡黑中和周邊往往存在淋巴細(xì)胞，而Th17 細(xì)胞及其特異性分泌的細(xì)胞因子IL-17 在MM 中發(fā)揮極其重要的作用。 IL-17 是一種重要的炎癥介質(zhì)， 與炎癥、腫瘤、過敏性疾病、自身免疫病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中γδ T 細(xì)胞作為免疫反應(yīng)早期IL-17 的最重要來源，因其在多種感染性疾病和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用而備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)將研究γδT17 細(xì)胞的聚集是否由于MM中促炎因子刺激分化和趨化因子誘導(dǎo)募集的結(jié)果。目的：探討MM 患者腫瘤、瘤旁和外周血γδT17 細(xì)胞與其他特異性T細(xì)胞亞型的相互作用，明確γδT17 細(xì)胞與患者預(yù)后及化療療效的相關(guān)性.方法：采用免疫組化和流式細(xì)胞技術(shù)檢測腫瘤組織、瘤旁組織γδT17細(xì)胞數(shù)量，并探討分泌IL-17 的T細(xì)胞之間的相關(guān)性結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示腫瘤組織中的γδT17 細(xì)胞數(shù)量均明顯高于瘤旁組織，流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示證實(shí)γδT17細(xì)胞內(nèi) CCL25 在惡黑組織中高表達(dá)。結(jié)論：惡黑腫瘤組織中的 γδT17 細(xì)胞遷移和富集可能是由 CCL25 介導(dǎo)的，在惡性黑色素瘤的發(fā)病中發(fā)揮重要作用

【關(guān)鍵詞】 惡黑;γδT17細(xì)胞;CCL25;趨化因子

黑龍江省省屬高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目 （2018-kyywfmy-0073）

1、材料和方法

1.1 收集臨床材料和標(biāo)本 收集于2018年1月至2021年1月在我院行手術(shù)治療的30例皮膚惡性黑色素瘤患者;年齡41-68歲。同期就診我院的30例色素痣患者為對照組，年齡35-65歲，本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。手術(shù)過程中收集癌組織和癌旁組織，用于石蠟組織包埋和提取單個(gè)核細(xì)胞用于免疫組織化學(xué) 流式細(xì)胞檢測。所需要的抗體均購于eB公司。

1.2流式細(xì)胞檢測 收集用于檢測的組織、外周血，分別經(jīng) ficoll 和 percoll

密度梯度離心富集淋巴細(xì)胞后，先染 viability dye 以排除死細(xì)胞，接著孵育細(xì)胞表面marker anti-CD4 和 anti-CD3 抗體，接著用 PMA（0.25?g/ml）、Ionomycin（0.25?g/ml）和 Golgi Stop 液處理細(xì)胞，然后固定破膜后加入抗體對 γδT17細(xì)胞和CCL25 進(jìn)行染色。用 FACS Fortessa 流式儀進(jìn)行上機(jī)檢測，收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用lowJo 軟件進(jìn)行分析γδT17細(xì)胞和CCL25的變化

1.3免疫組織化學(xué) 將包埋好的組織連續(xù)切成4μm 的切片，經(jīng)過烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、過氧化物酶滅活、加入一抗4攝氏度冰箱過夜、二抗37°孵育30分鐘、DAB顯色，蘇木素反藍(lán)、脫水、封片。以胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色著色為陽性表達(dá)，進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用 x ±s 表示，采用 t檢驗(yàn)，計(jì)量資料用例（%）表示，采用 χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用 Spearman 秩相關(guān)檢驗(yàn)。無進(jìn)展生存時(shí)間計(jì)算采用 Kaplan-Meier 法和 Log-rank 檢驗(yàn)，組間臨床資料的均衡性采用 χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

2.1 γδT17細(xì)胞在惡黑細(xì)胞中的表達(dá)情況

在本組惡性黑色素瘤腫瘤組織中，γδT17細(xì)胞的陽性表達(dá)達(dá)90%以上，而在瘤旁組織中的表達(dá)相對較低占45%，在正常組織中表達(dá)不明顯。

2.2惡性黑色素細(xì)胞腫瘤組織中瘤旁組織中趨化因子CCL25水平

3 討論

惡性黑色素瘤發(fā)病率約占到人體惡性腫瘤的 4%—5%。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，惡黑正以每年3%左右的速度在逐年遞增，因此對其潛在的發(fā)病機(jī)制研究和尋求 新的治療手段顯得尤為迫切。 腫瘤的免疫調(diào)控和免疫治療是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，有研究表明，在多種惡性腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移中往往存在淋巴細(xì)胞，而γδT17細(xì)胞及其特異性分泌的細(xì)胞因子 IL-17 在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮極其重要的作用。

IL-17 是一種重要的炎癥介質(zhì)， 與炎癥、腫瘤、過敏性疾病、自身免疫病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。早期的研究顯示活化的Th17 細(xì)胞主要通過分泌 IL-17（IL-17A）、IL-17F、IL-22、IL-21 等細(xì)胞因子發(fā)揮作用，并被認(rèn)為是 IL-17 的主要來源[4]。然而 Th17細(xì)胞的作用機(jī)制并不能解釋在一些應(yīng)激反應(yīng)及宿主免疫早期起重要作用的 IL-17 的產(chǎn)生。事實(shí)上，γδT 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等多種固有免疫細(xì)胞均可產(chǎn)生 IL-17。這些細(xì)胞多分布于隔開宿主和外界環(huán)境的皮膚和粘膜組織，并在免疫系統(tǒng)中扮演哨兵的角色。其中γδ T 細(xì)胞作為免疫反應(yīng)早期 IL-17 的最重要來源，因其在多種感染性疾病和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用而備受關(guān)注[5]。

CCL25 為主要表達(dá)于胸腺和小腸上皮的趨化因子，其受體 CCR9 可以調(diào)節(jié) CCR9 陽性細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)。近來研究表明，CCL25/CCR9 在多種腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在惡性黑色素瘤組織中存在CCL25和γδ TH17細(xì)胞的高表達(dá)，然后通過PI3K/AKT 途徑調(diào)控惡性細(xì)胞的凋亡。綜上所述，我們提出假說，所以我們認(rèn)為，CCL25 可能誘導(dǎo) γδT17 細(xì)胞向腫瘤組織遷移，該作用可能通過 CCL25/CCR9- BTLA- STAT5 信號途徑實(shí)現(xiàn)。

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