維生素D及其受體在炎癥性腸病相關腸纖維化中的作用研究進展

蘇麗坦古麗·麥合木提 周辛欣 季峰

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種以緩解與復發交替為特征的，可累及全消化道的慢性非特異性炎癥性疾病，主要分為克羅恩病（Crohn's disease，CD）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）。CD 病變累及腸壁全層，超過三分之一的CD患者會出現腸道狹窄和梗阻，需要手術治療；UC病變主要局限于黏膜及黏膜下層，過去認為UC是非纖維化疾病，但是近幾年的研究發現，3%～11.2%的UC患者會發生纖維化導致的結腸狹窄[1-3]，且在未發生結腸狹窄的UC患者結腸組織中也存在不同程度的纖維化[4]。近年來，盡管在對IBD炎癥的理解和抗炎治療方面取得了巨大的進展，但IBD患者發生腸纖維化的機制以及抗纖維化治療仍需進一步探索。目前IBD相關腸纖維化導致腸道狹窄患者的治療方案主要以控制癥狀為主的外科和內鏡治療，但這些治療后復發率高[5]，因此需進一步研發相關藥物來預防和治療腸纖維化，以提高IBD患者的生活質量并改善預后。

1 IBD相關腸纖維化的發生機制

IBD相關腸纖維化主要的發生機制為：在炎癥因子的長期刺激下，靜息的成纖維細胞、血管平滑肌細胞、上皮以及內皮細胞在轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）等各類調節因子[6]的作用下轉化成腸肌成纖維細胞并增殖活化，大量分泌以I型膠原為主的細胞外基質（extracellular matrix，ECM），使 ECM 過度沉積在腸壁，導致腸壁增厚，腸腔狹窄，最終形成腸梗阻[7]。其中TGF-β是存在于多種腸壁細胞中的多功能肽激素，在腸肌成纖維細胞的增殖活化[8]、上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[9-10]、ECM 的生成及降解[11-12]等過程中發揮關鍵性作用。因此，阻斷TGF-β信號通路是預防腸纖維化發生、發展的關鍵環節。此外，近年來研究發現腸道菌群在腸纖維化的發生、發展中發揮了重要作用。在動物模型研究中，將細菌成分肽聚糖多糖直接注射到無菌小鼠腸壁可誘導炎癥和纖維化，提示腸道菌群可以促進腸纖維化[13-14]。另一項體外研究表明，侵入腸壁的細菌及其產物可直接與腸肌成纖維細胞表面的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）結合，刺激腸肌成纖維細胞分泌細胞因子和趨化因子，導致腸纖維化的發生[15]。另外，有研究發現細菌鞭毛蛋白可以與腸間質細胞TLR5結合，參與腸道間充質細胞的成纖維反應[16]。

2 維生素D治療IBD相關腸纖維化的可能機制

1，25二羥基維生素D3是維生素D的主要活性代謝產物，是具有生物活性的脂溶性維生素。在IBD患者中，維生素D除了發揮調節鈣和骨穩態的作用之外，還具有抗炎癥反應、保護腸道黏膜屏障、維持腸道穩態以及免疫調節等作用[17]。而近期的多項研究表明，維生素D在肝、腎、肺及腹膜等多個組織器官中，通過與維生素D 受體（Vitamin D receptor，VDR）的結合來阻斷 TGF-β1/Smad信號轉導通路、抑制EMT從而發揮抗纖維化的作用[18-21]。然而，維生素D及VDR在IBD相關腸纖維化中的作用機制尚不清楚，以下就維生素D及VDR在IBD相關腸纖維化的作用及其可能機制的相關研究進行綜述，以期為IBD相關腸纖維化的藥物治療提供新的理論依據。

2.1 VDR與TGF-β1/Smad3信號通路 VDR分為細胞膜受體（mVDR）與細胞核受體（nVDR），后者屬于甾體類激素核受體超家族成員，廣泛分布于人類的小腸及結腸的腸黏膜上皮細胞內[22]。nVDR與1,25（OH）2D3結合后被激活，除了參與機體的鈣磷代謝調節之外，還在促進細胞增殖、分化及輔助維生素D發揮其免疫調節作用中起關鍵作用[23]。臨床研究發現，VDR在IBD患者腸黏膜中的表達水平顯著低于正常人[24]。另一項研究則發現維生素D可減輕IBD的疾病活動狀態，而這一作用依賴于與VDR受體的結合[25]。TGF-β是一種多功能細胞因子，在細胞的分裂、分化、遷移、黏附和死亡等過程中發揮重要作用，不僅影響組織損傷后創面的修復愈合，而且促進纖維化形成。TGF-β有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3種主要亞型，其中TGF-β1是多種纖維化性疾病的重要介質[26-27]。TGF-β1與其受體結合，磷酸化特異性受體并活化下游的Smad（Smad2和Smad3），與中介體Smad（Smad4）形成復合物并進入細胞核內，入核后可作為轉錄因子與其他DNA結合的輔助因子結合，調節膠原蛋白、基質金屬蛋白酶等纖維化分子的表達，從而促進組織器官的纖維化形成。Smad3的靶向破壞與細胞對TGF-β1的反應減弱有關。有研究表明，在肝星狀細胞中，維生素D通過VDR和Smad3之間的基因組拮抗作用抑制TGF-β1/smad3信號通路來阻斷促纖維化基因的表達，從而起到抗纖維化的作用[28]。這一研究提示維生素D通過VDR信號通路可以預防肝纖維化的發生。為了明確維生素D是否能預防IBD腸纖維化及其相關機制，Tao等[29]進行了一項小鼠結腸炎模型研究，該研究結果顯示，與未補充維生素D的小鼠相比，補充維生素D的小鼠結腸組織黏膜、黏膜下層和漿膜區域中的膠原沉積及總膠原生成量明顯減少；同時發現，2,4,6-三硝基苯磺酸誘導的結腸炎小鼠結腸組織中TGF-β1和Smad3磷酸化水平升高，而經不同劑量維生素D補充治療的小鼠結腸上皮下肌纖維母細胞（subepithelial myofibroblast，SEMF） 中 TGF-β1 和 Smad3 的mRNA水平顯著降低，并呈劑量依賴性。同時，在用特異性siRNA敲低VDR表達的小鼠結腸SEMF中，1,25（OH）2D3并不能下調TGF-β1誘導的α-平滑肌肌動蛋白和I型膠原α1基因 mRNA的表達，表明 1,25（OH）2D3對于TGF-β1/Smad3信號通路及促纖維化基因表達的抑制效應依賴于其受體VDR，提示VDR信號通路可能成為IBD相關腸纖維化的新的治療靶點。然而，根據目前現有的研究，維生素D對于IBD的治療效應仍不明確，VDR與Smad3信號通路之間的相互作用機制尚不清楚，需要大量的體內外試驗來進一步探索。

2.2 腸EMT途徑 越來越多的研究表明，1,25（OH）2D3可能會通過影響組織器官的EMT過程來預防纖維化的發生。既往研究表明，在小鼠單側輸尿管阻塞模型中，使用小干擾RNA敲低VDR可以模擬TNF-α促進EMT發生的過程，而VDR配體骨化三醇可逆轉敲低VDR引起的EMT。并且，與對照組相比，晚期服用活性維生素D也能有效恢復VDR的表達，同時抵消TNF-α和TGF-β1對EMT的促進作用，從而減少膠原蛋白的沉積及減輕輸尿管阻塞[30]。一項脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導的肺損傷動物模型研究顯示，維生素D處理可降低LPS誘導的Ⅱ型肺泡上皮間充質生物標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達[31]；該研究通過體外實驗證實，1,25（OH）2D3可以促進TGF-β刺激的原代人Ⅱ型肺泡上皮細胞中上皮細胞標志物的表達，同時抑制間充質細胞標志物的表達，從而抑制EMT；VDR拮抗劑干預可以消除維生素D對EMT的抑制作用。這一研究表明維生素D對于EMT的抑制效應依賴于VDR。同樣，Fischer等[21]發現維生素D活性劑骨化三醇可抑制TGF-β誘導支氣管上皮細胞（BEAS-2B）發生EMT。Yang等[20]的研究證實了 1,25（OH）2D3可通過 TGF-β/Smad途徑減弱高糖誘導的腹膜間皮細胞EMT和細胞凋亡。盡管目前沒有關于維生素D對腸纖維化形成中對EMT影響的直接研究報道，但是EMT是機體所有組織發生纖維化的關鍵。因此，根據以上的幾項研究結果，可以推測維生素D及其類似物可能通過抑制EMT的發生，發揮預防腸道纖維化的作用，但是仍需相關的直接研究證據來支持以上推測。

2.3 腸成纖維細胞活化途徑 腸纖維化的主要發生機制是ECM過度沉積，腸成纖維細胞激活后轉化而來的腸上皮下肌成纖維細胞被廣泛認為是ECM的主要來源。因此，成纖維細胞的活化是發生纖維化的重要步驟，抑制腸成纖維細胞的活化可成為治療腸纖維化的靶點之一。一項臨床研究發現，健康結腸組織中成纖維細胞表達VDR，并且證實其配體1,25（OH）2D3可調節與基質成纖維細胞的黏附、遷移、傷口愈合和基質重塑、趨化因子產生和炎癥反應功能相關的1 000多個基因的表達；同時，1,25（OH）2D3能降低成纖維細胞重組膠原纖維和收縮膠原凝膠的能力，而膠原凝膠的重組和收縮膠原凝膠的能力是成纖維細胞活化的兩個特征[32]。因此，筆者推測1,25（OH）2D3通過VDR調節成纖維細胞的生物學特性相關基因的表達，維持體內穩態，從而間接預防腸纖維化。

2.4 CTGF途徑 CTGF是由成纖維細胞在TGF－β1的刺激活化作用下產生的一種強有力的促纖維化細胞因子，作為TGF－β1的下游分子，在腸道ECM的積聚過程中發揮重要作用。有研究顯示，CD患者腸組織中CTGFmRNA的表達水平是正常腸組織的5倍，而且在嚴重腸組織纖維化的CD患者中，CTGFmRNA的表達水平升高更顯著，這表明CTGF在IBD相關腸纖維化的發生中可能發揮了重要作用[33]。有研究表明，維生素D可通過下調CTGF在組織中的表達水平從而起預防心肌、腎臟纖維化的作用[34-35]。另外，最近的一項小鼠模型研究表明，1,25（OH）2D3可降低腹膜CTGFmRNA的表達，同時伴隨腹膜熱休克蛋白47（heat shock protein 47，HSP47）的表達下調，及腹膜組織中膠原的沉積減少，表明1,25（OH）2D3可以通過下調CTGF表達，減少HSP47的積聚，進而減少膠原的異常沉積，從而起到抗腹膜纖維化的作用[36]。HSP47是一種位于內質網的膠原特異性分子伴侶，在多種類型的細胞和組織中，HSP47的表達與膠原的表達密切相關[37]，是治療纖維化疾病的一個潛在靶點。1,25（OH）2D3作用后CTGF及HSP47的一致變化趨勢，提示1,25（OH）2D3下調CTGF，可能通過抑制HSP47積聚，進而預防纖維化的發生。CTGF是ECM沉積的關鍵分子，它在IBD相關腸纖維化中有較高的表達，其表達水平與維生素D補充治療存在負相關性。因此，筆者推測，在腸道中補充維生素D可能通過抑制腸組織中CTGF的表達，預防腸纖維化的發生。另外，有研究稱CTGF生物學效應較為單一[38]，而TGF-β的生物學作用比較復雜，并且影響多種不同的細胞類型，因此CTGF可有望成為選擇性預防IBD纖維化的有效靶點。

2.5 保護腸道黏膜屏障及抗菌作用 另外，有研究認為IBD相關腸纖維化的形成與腸道屏障功能的破壞相關：遺傳易感性的個體在外界各種因素的刺激下導致腸道黏膜受損，腸道通透性增加，腸道菌群移位，引起食物及腸道細菌等抗原對腸道黏膜直接刺激，導致炎癥因子釋放，促進腸道間充質細胞向分泌ECM的腸肌成纖維細胞轉化，導致ECM在腸壁的過度沉積，最終形成腸纖維化。因此，維持腸道黏膜屏障的完整，可以預防腸纖維化發生。研究表明，1,25（OH）2D3可通過上調緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1的表達來增強腸上皮細胞間的緊密連接，維持腸道黏膜屏障的完整性，阻止細菌移入腸壁，避免腸黏膜下層直接接觸細菌及其產物，進而間接抑制腸纖維化的發生[39]。同時，研究表明1,25（OH）2D3激活VDR后，可以直接作用于單核細胞誘導抗菌蛋白表達的基因位點，從而增強其殺菌作用[40]。據報道，CD的小腸狹窄常發生在攜帶核苷酸結合寡聚化結構域蛋白 2（nucleotide-binding oligomerization domain 2，NOD2）基因多態性的個體中，其產物是能夠識別細菌產物胞壁酰二肽（MDP）的細胞內模式識別受體，而MDP是細菌肽聚糖中普遍存在的一種成分[41]。1,25（OH）2D3與VDR結合能夠誘導多種類型細胞的NOD2表達，增強對革蘭陰性菌及革蘭陽性菌的產物胞壁酰二肽的識別，同時誘導NOD2的下游關鍵轉錄因子NF-κB的活化入核，從而上調抗菌肽防御素β2的表達，起到殺滅病原菌的作用?；谏鲜鲅芯拷Y果，筆者推測維生素D能夠通過保護腸道屏障，增強機體對于病原菌的殺菌能力，從而減少細菌對腸黏膜的刺激，發揮間接預防腸纖維化的作用。

雖然結腸中存在大量的微生物，但由于小腸遠端即回腸末端存在一個門控系統，可以抑制微生物向小腸上段過度生長，所以小腸中的細菌數量非常有限。Paneth細胞位于小腸隱窩底部，分泌防御素和溶菌酶，在炎癥刺激下富集于小腸遠端，與腸道上皮的緊密連接共同形成腸道抗菌屏障，保護宿主免受內源性病原體的侵襲，并調節小腸管腔內定植菌的組成，在維持腸道穩態中發揮重要作用[42]。目前有研究假說認為小腸CD是由于Paneth細胞防御素缺乏，造成腸道抗菌屏障破壞及腸道菌群移位，進而導致一系列腸道炎癥反應[43]。研究發現，VDR在Paneth細胞富集的回腸末端高表達，這種獨特的腸道表達模式提示，腸道中的VDR信號可能通過調節腸道中的Paneth細胞及其防御素的分泌，從而抑制小腸中微生物的過度生長[44-45]。與這些觀點相一致，Wu等[46]在四氯化碳誘導的肝損傷小鼠模型研究中發現，與野生型小鼠組相比，敲除腸黏膜上皮細胞中VDR的小鼠組顯示出Paneth細胞防御素和溶菌酶的產生減少、腸道微生態失調及更嚴重的肝纖維化。既往的研究表明，小腸CD中Paneth細胞-防御素的減少與Wnt信號轉錄因子4（Tcf-4）的減少相關，Wnt信號可通過β-連環蛋白/Tcf-4轉導途徑誘導腸道中Paneth細胞的分化成熟[42]。因此，筆者推測在小腸CD中，維生素D信號可能通過上調Wnt/Tcf-4信號通路調節Paneth細胞及其防御素的產生來發揮抗菌效應，從而間接起到抗纖維化的作用。

3 總結與展望

據研究，VDR在IBD患者腸黏膜上皮細胞中的表達水平顯著低于正常人，維生素D可減輕IBD疾病活動性，而這一作用依賴于VDR信號通路。目前研究證實，維生素D可以通過活化VDR抑制TGF-β1和CTGF等促纖維化因子信號通路、腸EMT、成纖維細胞的活性及增強機體的殺菌能力等途徑，在眾多纖維化疾病中起到預防和治療的作用。而TGF-β1和CTGF促纖維化因子信號通路的激活、腸EMT、成纖維細胞活化及腸道菌群變化是機體組織發生腸纖維化的重要環節，因此筆者推測維生素D可能同樣通過上述幾種途徑在IBD中發揮預防和治療腸纖維化的作用，可被推薦用于IBD相關腸纖維化的治療中，至少作為一種輔助治療手段減緩腸纖維化的發生、發展。但是目前的研究多集中于其他組織細胞和動物模型研究，有關維生素D治療IBD相關腸纖維化的直接研究仍然很少，因此需要大量、更直接全面的基礎和臨床研究，為臨床上維生素D治療IBD相關腸纖維化提供循證依據。

總之，目前在分子水平上，維生素D防治IBD相關腸纖維化的機制尚未完全明了，在臨床上，缺乏相關的臨床研究證據。因此，對上述機制的深入研究將為IBD相關腸纖維化的新治療方法的研發奠定基礎，將來維生素D有望作為一種新興的治療IBD相關腸纖維化的藥物。