SARS-CoV-2 S蛋白及其受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的研究進(jìn)展

丁海麥 李彩艷 閆巧梅 張學(xué)明

2019年12月，新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）疫情在武漢暴發(fā)。新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）利用S蛋白S1亞基與人細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（HACE2）結(jié)合，通過宿主蛋白酶激活S2亞基，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，其傳染性、致病性較非典型肺炎病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）更強(qiáng)，其中S蛋白在很大程度決定了該病毒的組織嗜性和致病性[1-2]。目前對SARSCoV-2的研究熱點(diǎn)主要集中在S蛋白、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）結(jié)構(gòu)及S蛋白介導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞機(jī)制等，本研究對SARS-CoV-2 S蛋白及其受體ACE2的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 SARS-CoV-2

冠狀病毒是一類具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子形狀不規(guī)則，直徑約60～220 nm，外包膜有蘑菇狀蛋白刺突；可分為Letovirinae和冠狀病毒兩個(gè)亞科，其中冠狀病毒亞科又分為α-CoV、β-CoV、γ-CoV、δ-CoV等4個(gè)屬，蝙蝠、鼠類、鳥類、家禽和家畜等都是冠狀病毒宿主，其中蝙蝠是最主要的自然宿主，所攜帶的病毒約35%為冠狀病毒。多數(shù)冠狀病毒對人和動(dòng)物具有致病性，α-CoV、β-CoV可引起人類和哺乳動(dòng)物呼吸道、腸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，γ-CoV、δ-CoV主要感染禽類。目前可感染人類的冠狀病毒僅有 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoVHKU1、SARS-CoV、MERS-CoV[3]和 SARS-CoV-2，其中SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2的致病性及傳播力較強(qiáng)。

根據(jù)前3個(gè)測定的SARS-CoV-2基因組序列對其基因組注釋，SARS-CoV-2基因組有14個(gè)ORF編碼27種蛋白。基因組5'末端的orf1ab和orf1a基因分別編碼pp1ab和pp1a蛋白，這兩種蛋白包含15種非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp，具體為 nsp1～nsp10，nsp12～nsp16）；基因組3'端編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（刺突蛋白S、包膜蛋白E、基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N）和8種輔助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b 和 orf14）。與數(shù)據(jù)庫相關(guān)冠狀病毒進(jìn)行比較，氨基酸水平上SARS-CoV-2與SARSCoV非常相似，但有一些明顯差異，如8a蛋白存在于SARS-CoV中，而SARS-CoV-2中則無；8b蛋白在SARSCoV中為84個(gè)氨基酸，而SARS-CoV-2中則為121個(gè)氨基酸；3b蛋白在SARS-CoV中為154個(gè)氨基酸，而在SARS-CoV-2中則只有22個(gè)氨基酸。基于全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，SARS-CoV-2與人CoV、MERSCoV、蝙蝠CoV、SARS樣蝙蝠CoV和SARS-CoV處于同一β冠狀病毒演支，SARS-CoV-2在整個(gè)基因組序列方面更接近SARS樣蝙蝠CoV，基因組與SARS樣蝙蝠CoV（MG772933）的基因組相似度最高，SARSCoV則由SARS樣蝙蝠CoV進(jìn)化而來，甚至SARSCoV-2與Bat-SL-CoVZC45的nsp7和E蛋白氨基酸序列完全相同，表明蝙蝠可能是SARS-CoV-2的宿主[4]。

2 ACE2

SARS-CoV-2細(xì)胞受體ACE2是羧肽酶ACE的同源物，羧肽酶生成血管緊張素Ⅱ，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的主要活性肽。目前認(rèn)為ACE2主要功能有負(fù)調(diào)節(jié)RAS、參與腸腎中性氨基酸吸收及SARSCoV-2與SARS-CoV進(jìn)入細(xì)胞受體等。

2.1 RAS 在RAS中，ACE把腎素切割血管緊張素原產(chǎn)生的血管緊張素（Ang）Ⅰ再次切割成AngⅡ。AngⅡ是RAS的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可通過兩個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)血管強(qiáng)效收縮、細(xì)胞生長、肥大細(xì)胞以及炎性細(xì)胞因子的分泌、導(dǎo)自由基的生成和氧化分解等生物學(xué)功能。

2000年發(fā)現(xiàn)了一種新的、與人類ACE相關(guān)的羧肽酶ACE2，該基因定位于X染色體p2段2，包含18個(gè)外顯子。ACE2由805個(gè)氨基酸組成，分子量約為120 kD，包含N端肽酶結(jié)構(gòu)域（PD）和C端Collectrin樣結(jié)構(gòu)域（CLD），CLD末尾有單個(gè)跨膜螺旋和一個(gè)含約40個(gè)殘基的細(xì)胞內(nèi)段。ACE2可以降解AngⅡ?yàn)锳ng1-7；還可以直接水解AngⅠ，產(chǎn)生無活性的Ang1-9肽，然后通過ACE或其他肽酶轉(zhuǎn)化為血管擴(kuò)張肽Ang1-7；還可以對抗ACE與 AngⅡ，發(fā)揮舒張血管、抗組織纖維化、抗增殖和利尿等作用，對激活的RAS進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[5]。此外，ACE2還可以通過ACE2/apelin信號(hào)發(fā)揮重要的心血管保護(hù)作用，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及血壓調(diào)控[6]。

2.2 ACE2及其同源物Collectrin轉(zhuǎn)運(yùn)中性氨基酸BoAT1（SLC6a19）是腎臟和小腸上皮細(xì)胞主要的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，BoAT1 mRNA在腎臟近端小管和小腸高表達(dá)，蛋白定位在小腸上皮細(xì)胞和腎臟近端小管上皮細(xì)胞刷狀緣。研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)ACE2表達(dá)可提高腸黏膜中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體BoAT1的活性，從而增加中性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，只有BoAT1存在時(shí)，僅能低效率地轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸，而與ACE2結(jié)合后，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率可增加至原來的10倍，提示 ACE2與BoAT1相結(jié)合并不能改變BoAT1對氨基酸的選擇性，但能極大地提高其對氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)速率[7]。定位于腎臟近端小管的刷狀緣ACE2的同源物Collectrin是一種非催化蛋白，它在腎近端小管中性氨基酸再吸收過程中起關(guān)鍵作用[8]。

2.3 S受體 SARS-CoV-2與SARS-CoV的S蛋白氨基酸同源高達(dá)80%，SARS-CoV的S多克隆抗體能有效中和SARS-CoV-2 S蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)入，說明兩者的S蛋白結(jié)構(gòu)相似，推測SARS-CoV-2同SARSCoV一樣借助S蛋白與受體細(xì)胞ACE2結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞。BHK-21細(xì)胞系對SARS-CoV-2和SARS-CoV不敏感，正常情況下兩種病毒無法有效侵染BHK-21，當(dāng)BHK-21表達(dá)ACE2后，ARS-CoV-2同SARS-CoV一樣能有效侵染BHK-21細(xì)胞[2]。

SARS-CoV-2與SARS-CoV受體都是ACE2，那么S蛋白如何結(jié)合ACE2？獲得ACE2在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定存在狀態(tài)有助于解決這一問題。ACE2為膜蛋白，很難在體外獲得穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。有研究借助腸道內(nèi)ACE2與BoAT1能夠形成穩(wěn)定復(fù)合物，通過共表達(dá)獲得ACE2與BoAT1穩(wěn)定復(fù)合物，用冷凍電鏡成功解析了ACE2-BoAT1三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ACE2以二聚體形式存在，維持二聚體的作用力主要是兩個(gè)ACE2單體頸部結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基相互作用力，而PD之間的作用力很弱，這種弱作用力便于PD轉(zhuǎn)位而呈現(xiàn)出“開放”和“關(guān)閉”兩種構(gòu)象[9]。無論是開放狀態(tài)還是關(guān)閉狀態(tài)，PD都能與S蛋白結(jié)合。因此，二聚體ACE2可同時(shí)容納兩個(gè)S蛋白三聚體，這種聚集作用有助于膜的內(nèi)陷和病毒顆粒的內(nèi)吞。ACE2的PD存在6個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中Asn53、Asn90、Asn322三糖基化位在RBD結(jié)合位點(diǎn)附近，糖基化能使病毒逃過人體免疫細(xì)胞識(shí)別和攻擊。氯喹能干擾ACE2的末端糖基化，減少病毒與受體細(xì)胞膜上ACE2的結(jié)合，納入SARS-CoV-2治療方案[10]。此外，ACE2的C末端（特別697-716）存在TMPRSS2蛋白酶切割位點(diǎn)，ACE2與S蛋白結(jié)合后，TMPRSS2蛋白切割A(yù)CE2，有助于S蛋白驅(qū)動(dòng)的病毒進(jìn)入[11]。

借助ACE2單細(xì)胞表達(dá)水平，評(píng)估SARS-CoV-2除呼吸系統(tǒng)外對其他主要器官的潛在損傷。SARSCoV-2最主要的靶點(diǎn)是肺Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AT2）和巨噬細(xì)胞，其次是心肌細(xì)胞和腎上腺基質(zhì)細(xì)胞，最后是睪丸、卵巢和甲狀腺的基質(zhì)細(xì)胞。由于極化的腎近端小管細(xì)胞、肝膽管細(xì)胞和腸細(xì)胞ACE2定位在細(xì)胞的頂端區(qū)域，病毒不容易到達(dá)，不是SARS-CoV-2的主要靶器官。提示SARS-CoV-2患者除急性呼吸窘迫綜合征外，治療期間還應(yīng)注意心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的潛在傷害[12]。

值得注意的是，當(dāng)SARS-CoV S蛋白與ACE2結(jié)合后，導(dǎo)致ACE2水平下降，AngⅡ水平升高，RAS激活，進(jìn)而導(dǎo)致免疫反應(yīng)失衡，炎癥風(fēng)暴啟動(dòng)，迅速引起單器官或多器官功能衰竭，最終威脅生命。已有小鼠實(shí)驗(yàn)表明，ACE2能改善SARS－CoV、酸吸入和敗血癥等引起的急性肺損傷，重組人ACE2能改善SARS-CoV引起的急性肺損傷[13]。最近研究發(fā)現(xiàn)，一部分人感染SARS-CoV-2后或受刺激性細(xì)胞因子（如干擾素）的刺激，ACE2表達(dá)顯著上升，加速SARS-CoV-2通過ACE2進(jìn)入受體細(xì)胞，促進(jìn)其復(fù)制和擴(kuò)散[14]。關(guān)于干擾素治療SARS-CoV-2的利弊如何，仍需進(jìn)一步研究明確。

3 S蛋白

冠狀病毒侵染受體細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要S蛋白與受體結(jié)合及宿主蛋白酶協(xié)同作用。S蛋白是位于病毒包膜表面呈刺突狀的高度糖基化、同源三聚體Ⅰ膜融合蛋白。S蛋白是由S1亞基和S2亞基組成。S1亞基含受體結(jié)合域（RBD），是決定細(xì)胞嗜性、宿主范圍和動(dòng)物傳播的關(guān)鍵部分。S2亞基含有疏水性融合環(huán)和2個(gè)七重復(fù)區(qū)域（HR1和HR2），具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)病毒包膜和細(xì)胞膜的融合。在S蛋白特定位點(diǎn)切割是侵染宿主細(xì)胞的前提，對于多數(shù)冠狀病毒而言，在S蛋白S1和S2亞基之間的邊界區(qū)及S2'存在蛋白酶切割位點(diǎn)。常見的蛋白酶有跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS2）、組織蛋白酶 B/L（CatB/L）及Furin等。與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2 S蛋白S1和S2亞基之間的邊界區(qū)多Furin位點(diǎn)，且兩者S蛋白結(jié)構(gòu)不同。

3.1 S蛋白S1和S2亞基邊界Furin位點(diǎn) 比較SARS-CoV-2與SARS-CoV核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，在SARS-CoV-2 S蛋白S1和S2亞基之間的邊界處插入PRRA的4個(gè)氨基酸殘基后，該位點(diǎn)可被Furin切割[15]。目前已測序的SARS-CoV-2分離株都存在Furin位點(diǎn)，而與其密切相關(guān)的RaTG13 S蛋白中卻沒有發(fā)現(xiàn)Furin位點(diǎn)。借Furin位點(diǎn)就可將SARS-CoV-2與SARS-CoV等冠狀病毒區(qū)分開來。

同其他Furin病毒一樣，SARS-CoV-2 S蛋白在生物合成過程中就被宿主高爾基體Furin在S1/S2邊界區(qū)切割。因此，在S1和S2亞基膜融合前構(gòu)象中以非共價(jià)結(jié)合。SARS-CoV-2病毒包裝機(jī)制與埃博拉、HIV等一樣，而不同于SARS-CoV。進(jìn)一步說明 S1/S2邊界Furin切割對SARS-CoV-2感染宿主細(xì)胞的影響，構(gòu)建了缺少PRRA氨基酸殘基的S蛋白突變體（Sfur/mut）假病毒（MLV），突變體假病毒出芽時(shí)S蛋白沒有被切割，發(fā)現(xiàn)突變體假病毒侵染VeroE6細(xì)胞（不表達(dá)ACE2）效率高于野生型假病毒，而對轉(zhuǎn)染hACE2的BHK細(xì)胞的侵染效率則相反[16]。說明Furin切割主要不是參與S蛋白介導(dǎo)膜融合，而同其他高致病性禽流感病毒及MERS-CoV一樣，SARS-CoV-2 S蛋白包裝前Furin切割，有助于RBD與ACE2結(jié)合及隨后的TMPRSS2切割，擴(kuò)大宿主趨向性及致病性。由于Furin幾乎在所有類型細(xì)胞中都表達(dá)，相比SARS-CoV，SARS-CoV-2宿主更廣，傳染性及致病性更強(qiáng)。

3.2 S蛋白與ACE2結(jié)合 不同種類的冠狀病毒借助S1亞基不同結(jié)構(gòu)域來識(shí)別、附著受體。如人類冠狀病毒HCoV-OC43和HCoV-HKU1借助S1亞基結(jié)構(gòu)域A結(jié)合宿主細(xì)胞表面的糖蛋白和糖脂上的5-N-乙酰基-9-O-乙酰基唾液酸苷感染易感細(xì)胞；MERS-CoV借助S蛋白N端結(jié)構(gòu)域A先結(jié)合附著宿主細(xì)胞表面的唾液糖多和黏液蛋白，隨后結(jié)構(gòu)域B與受體二肽基肽酶 4（DPP4/CD26）結(jié)合；而 SARS-CoV-2及 SARSCoV則通過S1亞基RBD直接與ACE2相互作用而進(jìn)入靶細(xì)胞。RBD位于S1亞基C端306-575區(qū)域，其中424-494為受體結(jié)合基序（RBM）直接介導(dǎo)與ACE2的相互作用。盡管SARS-CoV-2及SARS-CoV S1亞基RBD結(jié)構(gòu)相似，但在RBD與ACE2作用界面上發(fā)現(xiàn)十幾個(gè)氨基酸改變[17]。這些變化整體上增強(qiáng)了SARSCoV-2 RBD與ACE2之間的親和力。

冠狀病毒顆粒與受體細(xì)胞結(jié)合前，S蛋白通常以亞穩(wěn)定的預(yù)融合狀態(tài)存在。為了接合受體，S1的RBD經(jīng)歷鉸鏈狀構(gòu)象運(yùn)動(dòng)，該構(gòu)象運(yùn)動(dòng)不時(shí)隱藏或暴露RBD結(jié)合受體位點(diǎn)。這兩個(gè)狀態(tài)分別稱為“向下”構(gòu)象和“向上”構(gòu)象，其中向下對應(yīng)于受體不可及的狀態(tài)，向上對應(yīng)于受體可及的狀態(tài)。SARS-CoV S蛋白的3個(gè)RBD均處于“向下”構(gòu)象，緊緊地包住鄰近的N末端結(jié)構(gòu)域（NTD），無法結(jié)合ACE2。RBD通過鉸鏈狀構(gòu)象運(yùn)動(dòng)從“向下”構(gòu)象變?yōu)椤跋蛏稀睒?gòu)象，該構(gòu)象下RBD沒有空間位阻順利結(jié)合ACE2。而SARS-CoV-2處于“向下”構(gòu)象的RBD的角度更靠近三聚體中心位置，其中3個(gè)RBD中的1個(gè)處于“向上”構(gòu)象，與SARS-CoV相比SARS-CoV-2更容易與ACE2結(jié)合[18]。SARS-CoV-2 S蛋白與ACE2結(jié)合時(shí)，ACE2與1個(gè)向上構(gòu)象的RBD結(jié)合導(dǎo)致3個(gè)RBD都形成不穩(wěn)定“向上”構(gòu)象。RBD與受體結(jié)合后破壞了S蛋白亞穩(wěn)定狀態(tài)，導(dǎo)致S1亞基的脫落，S2'位點(diǎn)被宿主蛋白酶水解，S2亞基構(gòu)象變化暴露出融合肽，隨后融合肽插入宿主細(xì)胞膜并與之融合，將核酸分子釋放進(jìn)入胞內(nèi)，完成侵染過程。

3.3 S蛋白介導(dǎo)SARS-CoV-2進(jìn)入受體細(xì)胞 根據(jù)病毒和細(xì)胞類型不同，S蛋白與受體結(jié)合后，利用宿主TMPRRS2、CatB/L、Furin、胰蛋白酶等水解 S2 亞基暴露融合肽。這些蛋白酶在靶細(xì)胞上的有效性很大程度上決定了冠狀病毒是通過細(xì)胞膜還是內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。冠狀病毒S2亞基中存在兩個(gè)重要的保守重復(fù)氨基酸序列，即HR1和HR2，共同形成6-HB螺旋結(jié)構(gòu)。6-HB在病毒包膜與宿主膜融合過程中起主要作用。

TMPRRS2是一類定位于細(xì)胞膜上具有保守絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白酶，C端蛋白酶結(jié)構(gòu)域在胞外，N端位于胞內(nèi)。現(xiàn)已表明TMPRRS2是SARS-CoV及其他冠狀病毒細(xì)胞膜融合進(jìn)入宿主細(xì)胞不可缺少的蛋白酶[19]。為了評(píng)估TMPRRS2對S蛋白驅(qū)動(dòng)SARS-CoV-2侵染細(xì)胞的影響，用氯化銨提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)境PH抑制CatB/L活性，發(fā)現(xiàn)S蛋白驅(qū)動(dòng)SARSCoV-2侵染293T細(xì)胞（不表達(dá)TMPRSS2）受到強(qiáng)烈抑制，而侵染Caco-2細(xì)胞（表達(dá)TMPRSS2）基本無影響。SARS-CoV-2同SARS-CoV一樣，S蛋白與ACE2結(jié)合后借助宿主TMPRRS2切割S2'，激活融合蛋白活性，誘導(dǎo)受體依賴性合胞體的形成[20]。

比較SARS-CoV-2和SARS-CoV與細(xì)胞膜融合效率，將分別表達(dá)SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白的293T細(xì)胞與表達(dá)ACE2的293T細(xì)胞在合適的條件下共培養(yǎng)一段時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果S蛋白是SARSCoV-2的，就會(huì)出現(xiàn)合胞體；如果S蛋白是SARS-CoV的，就沒有合胞體；沒有S蛋白或者ACE2，也不會(huì)形成合胞體。與臨床結(jié)果一致，SARS-CoV-2 S蛋白介導(dǎo)的膜融合能力要更強(qiáng)，進(jìn)入細(xì)胞的效率更高。分析原因，比較兩者S2亞基的HR1和HR2的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩者的HR2的同源性是100%，HR1有8個(gè)氨基酸不同[21]。SARS-CoV-2 HR1中8個(gè)氨基酸替換增強(qiáng)了HR1和HR2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，進(jìn)一步穩(wěn)定6-HB結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致病毒包膜和細(xì)胞膜融合能力增強(qiáng)。

有研究利用構(gòu)建的SARS-CoV-2假病毒轉(zhuǎn)染HEK293/hACE2細(xì)胞，分別用溶酶體抑制劑、氯化銨和bafilomycin A處理HEK293/hACE2細(xì)胞，評(píng)價(jià)不同內(nèi)吞體宿主蛋白酶對病毒包膜與內(nèi)吞體膜融合的影響，與對照組相比，20 mm NH4Cl和100 nm bafilomycin A處理HEK293/hACE2后，SARS-CoV-2假病毒侵染率減少98%以上[21]，這表明SARS-CoV-2假病毒主要通過受體依賴內(nèi)吞進(jìn)入HEK293/hACE2細(xì)胞。冠狀病毒選擇胞質(zhì)膜還是內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，與相應(yīng)蛋白酶在靶細(xì)胞上的有效性和靶細(xì)胞所處環(huán)境有關(guān)。

4 小結(jié)

SARS-CoV-2引發(fā)的疫情正在全球范圍內(nèi)暴發(fā)，確診感染人數(shù)還在持續(xù)猛增中。SARS-CoV-2 S蛋白暴露于病毒表面并介導(dǎo)感染宿主細(xì)胞，S蛋白是感染后中和抗體的主要靶點(diǎn)，也是治療和疫苗設(shè)計(jì)的焦點(diǎn)。針對S蛋白R(shí)BM區(qū)域設(shè)計(jì)抗體，直接阻斷其與ACE2結(jié)合活性的效果更好，但RBM序列保守程度較低，針對RBM區(qū)域的交叉保護(hù)抗體可能更難獲得。RBM基序以外更保守區(qū)域的抗體具有交叉保護(hù)中和活性，缺乏ACE2阻斷活性，抗體可能不那么有效。目前以ACE2為靶點(diǎn)的老藥新用及利用重組人類ACE2蛋白中和SARS-CoV-2阻止SARS-CoV-2進(jìn)入受體細(xì)胞，為治療和預(yù)防SARS-CoV-2感染提供了一種新方案。