外泌體在侵襲性前列腺癌中的研究進(jìn)展

萬 順 杜方明 米 軍

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科（甘肅蘭州730000）

一、前言

前列腺癌（Prostatic Cancer，PCa）是全球男性癌癥死因的第二大因素，據(jù)2018年的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，全球有近128萬新發(fā)病例和35.9萬死亡病例[1]。PCa分為惰性PCa和侵襲性PCa，惰性前列腺癌通常指Gleason評(píng)分≤6分、分期T2a、癌灶總體積≤0.5ml，侵襲性前列腺癌通常指Gleason評(píng)分＞7分、癌灶總體積＞0.5ml或穿刺腫瘤直徑＞6mm。侵襲性PCa通常會(huì)在局部浸潤或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移至其他器官，從而導(dǎo)致較高的死亡率[2]。侵襲性PCa高死亡率的原因之一是當(dāng)前的診斷方法存在不足，一直以來，侵襲性PCa的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是基于血清前列腺特異性抗原（Prostate Specific Antigen,PSA）水平而進(jìn)行的超聲引導(dǎo)下經(jīng)直腸前列腺穿刺活檢[3]；但是這種方法具有侵入性，并且基于PSA的閾值作為穿刺活檢的標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)導(dǎo)致大量不必要的活檢及漏診。所以當(dāng)前發(fā)展高特異性、高靈敏度的無創(chuàng)檢測方法是一種趨勢。外泌體是一類由細(xì)胞分泌的膜性囊泡小體，廣泛存在于多種體液環(huán)境中，它是一種包含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的生物載體，可以在人體的血液、精液、尿液中檢測到[4]，到目前為止外泌體在診斷消化系統(tǒng)惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、泌尿生殖道惡性腫瘤以及其他惡性腫瘤中的作用已經(jīng)得到廣大科研人員的重視[5]。外泌體在PCa檢測中的高靈敏度及準(zhǔn)確度也已經(jīng)得到肯定。當(dāng)前PCa臨床管理中的主要挑戰(zhàn)是無法通過傳統(tǒng)的診斷方法準(zhǔn)確地區(qū)分惰性PCa和侵襲性PCa，而外泌體能夠準(zhǔn)確地檢測及識(shí)別侵襲性PCa進(jìn)而及時(shí)地治療，這不僅能夠有效地延緩PCa的進(jìn)展，更能延長患者的生命。

二、外泌體miRNA

（一）外泌體MiR-1246

MiR-1246是一種小的非編碼RNA，通過與同源mRNA靶標(biāo)的3'非翻譯區(qū)（Untranslated Region,UTR）進(jìn)行序列特異性相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)[6]，它是一種大量存在于外泌體中的穩(wěn)定生物標(biāo)記物，可以從人體血液中提取而來。在Bhagirath D等人[7]研究中，他們篩選出正常人組、良性前列腺增生（Benign Prostate Hyperplasia,BPH）組、惰性PCa組和侵襲性PCa組血液中的外泌體miRNA，比較發(fā)現(xiàn)有三種顯著上調(diào)的miRNA（miR-1246，miR-302c-3p，miR-509-5p）。其中外泌體miR-1246在侵襲性PCa中的表達(dá)相較于正常組上調(diào)了約31倍，相較于BPH組上調(diào)了約23倍。在侵襲性PCa中外泌體miR-1246特異性上調(diào)，而另外一個(gè)被觀察到的有趣的結(jié)果顯示：外泌體miR-1246的水平隨著PCa病理分期的增加而增加。除此之外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與該外泌體中的miRNA高表達(dá)有很強(qiáng)的相關(guān)性，由此我們可以聯(lián)想該miRNA可能預(yù)測腫瘤侵襲程度/局部轉(zhuǎn)移。也有研究表示MiR-1246可以作為侵襲性PCa的潛在新型生物標(biāo)志物，不僅可用于疾病診斷，也可預(yù)測疾病階段[8]。

（二）外泌體miR-888

miRNA是一類在PCa中表現(xiàn)出廣泛失調(diào)的小型非編碼RNA，而miR-888是在人類侵襲性細(xì)胞中差異最顯著的miRNA。一項(xiàng)研究顯示不僅可以從血液中檢測到外泌體miR-888，從人體前列腺液中也是可以檢測到外泌體miR-888[9，10]。miR-888與PCa的進(jìn)展有關(guān)，并且miR-888的水平與侵襲性PCa的侵襲程度呈正相關(guān)[9]。Lewis H等人[10]通過收集前列腺分泌物后篩選出與侵襲性PCa相關(guān)的miRNA，在侵襲性前列腺癌細(xì)胞與惰性前列腺癌細(xì)胞中分析外泌體miR-888簇的含量及表達(dá)水平，通過比較發(fā)現(xiàn)在侵襲性PCa細(xì)胞中富含外泌體miR-888。也有研究證實(shí)了外泌體中的miR-888誘導(dǎo)人PCa細(xì)胞的增殖、遷移和集落形成[9]。因此，從前列腺分泌物中篩查外泌體miR-888可以幫助臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地對(duì)PCa患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層，這不僅可能避免惰性PCa的過度診斷及治療，更能針對(duì)侵襲性PCa進(jìn)行多模式個(gè)性化治療。

（三）外泌體miR-2909

miR-2909是一種雄激素誘導(dǎo)的miRNA，可通過減弱TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的腫瘤抑制作用發(fā)揮其致癌作用[11]，它可以從人體尿液外泌體中分離出來，并且其募集程度與PCa的分期呈正相關(guān)。Wani S等人[12]將PCa受試者分低風(fēng)險(xiǎn)(Low Risk,LR)、中等風(fēng)險(xiǎn)(Intermediate Risk,IR)和高風(fēng)險(xiǎn)(High Risk,HR)組；然后分別從LR、IR和HR組中分離出外泌體中的miRNA，通過分析發(fā)現(xiàn)HR組中外泌體miR-2909的募集程度顯著高于LR及IR組，并且尿外泌體中miR-2909募集程度與Gleason評(píng)分顯示的PCa嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。由此可見，尿液外泌體中miR-2909具有成為檢測侵襲性PCa的非侵入性生物標(biāo)志物的潛力。

綜上，為了避免惰性PCa的過度治療，將外泌體作為無創(chuàng)性檢測侵襲性PCa的診斷方法是最好的選擇，而創(chuàng)建一種外泌體評(píng)分能夠很好地將PCa分為低危、中危、高危類別。Mihelich BL等人[13]為了評(píng)估術(shù)前血清外泌體中miRNA的診斷和預(yù)后價(jià)值，分析了50例BPH男性和100例PCa男性，PCa患者中包含50例確診為惰性PCa患者和50例確診為侵襲性PCa患者。在侵襲性PCa里發(fā)現(xiàn)14種外泌體中miRNA的表達(dá)水平相較于惰性PCa與BPH低，將這14種外泌體中miRNA表達(dá)水平通過統(tǒng)計(jì)學(xué)換算成外泌體miR評(píng)分，于是產(chǎn)生了兩個(gè)miR分?jǐn)?shù)；其中miR score1是外泌體miRNA在PCa患者中的平均表達(dá)水平對(duì)應(yīng)乘上測量的外泌體miRNA水平之后的和，而miR score2則是外泌體miRNA分別在BPH與PCa患者中的平均表達(dá)水平對(duì)應(yīng)乘上測量的BPH與PCa患者的外泌體miRNA水平之后的和，具體計(jì)算如下：

假設(shè)在50例BPH與50例PCa患者尿液或血液中檢測到7種外泌體miRNA（miR1至miR7）。

分別計(jì)算出miR1至miR7在50例PCa患者中的平均值，分別記為X1至X7。

分別計(jì)算出miR1至miR7在50例BPH患者中的平均值，分別記為Y1至Y7。

則miR score1=（X1 x實(shí)測值miR1）+（X2 x實(shí)測值miR2）+…+（X7 x實(shí)測值miR7）

miR score2=（Y1 x實(shí)測值miR1）+（Y2 x實(shí)測值miR2）+…+（Y7 x實(shí)測值miR7）

7.19可以作為miR score1的閾值，當(dāng)大于7.19時(shí)可認(rèn)為該患者為侵襲性PCa，小于7.19時(shí)則認(rèn)為該患者為惰性PCa。

7.85可以作為miR score2的閾值，當(dāng)大于7.85時(shí)可認(rèn)為該患者為BPH或惰性PCa，小于7.85時(shí)則認(rèn)為該患者為侵襲性PCa。

（文檔中相關(guān)數(shù)據(jù)從Mihelich BL等人[13]的研究中提?。?/p>

miR評(píng)分越高顯示疾病的侵襲程度越強(qiáng)，經(jīng)過優(yōu)化的miR score1可以將惰性PCa患者與侵襲性PCa患者區(qū)分開，而miR score2可以將BPH、低級(jí)PCa與侵襲性PCa患者區(qū)分開來[13]。該miRNA評(píng)分對(duì)侵襲性PCa患者有實(shí)用價(jià)值。Gleason評(píng)分反映了PCa的分化程度，并與PCa的侵襲性程度有關(guān)；因此可以將Gleason評(píng)分及外泌體miRNA評(píng)分相結(jié)合應(yīng)用，以更好地區(qū)分出惰性PCa及侵襲性PCa。

三、外泌體PCA3和PRAC

PCa抗原基因3（Prostate Cancer Antigen Gene 3，PCA3）是一種長的非編碼RNA，僅在PCa組織中表達(dá)，而與血清PSA水平及前列腺體積、大小無關(guān)[14]。PCa易感性候選物 （Prostate Cancer Susceptibility Candidate,PRAC）是編碼382個(gè)核苷酸RNA的新基因，有研究顯示它在侵襲性PCa中表達(dá)下調(diào)，證明了它與侵襲性PCa相關(guān)[15]。最近有研究人員從尿液里分離出了外泌體PCA3和PRAC，這是預(yù)測易感人群的一種非侵入性檢測方法[16]。Ye L F等人[16]對(duì)收集的89名初次或者重復(fù)前列腺活檢穿刺患者的尿液樣本里分離出的外泌體中的PCA3和PRAC進(jìn)行分析，結(jié)果表明外泌體中PCA3的表達(dá)在侵襲性PCa中增加更為明顯，而惰性PCa組的外泌體中PRAC表達(dá)顯著降低。將PCA3和PRAC的表達(dá)水平結(jié)合用以轉(zhuǎn)換成LBXexo分?jǐn)?shù)評(píng)分，LBXexo評(píng)分定義為相對(duì)于PRAC表達(dá)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換PCA3的表達(dá)水平，具體計(jì)算如下：

假設(shè)在PCa患者尿液樣本中測得外泌體PRAC與外泌體PCA3值分別為PRAC與PCA3。

則LBXexo評(píng)分=Log（PRAC）PCA3

LBXexo評(píng)分值越大表明其侵襲性越強(qiáng)，當(dāng)LBXexo評(píng)分值大等于5時(shí)，可百分百預(yù)測PCa等級(jí)。

（文檔中相關(guān)數(shù)據(jù)從Ye LF等人[16]的研究中提?。?/p>

在PSA水平低于20ng/ml的活檢陽性的侵襲性PCa中，LBXexo評(píng)分對(duì)PCa侵襲程度判定優(yōu)于單獨(dú)的外泌體PCA3/PRAC，并且LBXexo評(píng)分測試可以對(duì)前列腺癌危險(xiǎn)分層[16]。綜上，外泌體中PCA3和PRAC不僅可以單獨(dú)預(yù)測侵襲性PCa，其結(jié)合產(chǎn)物L(fēng)BXexo評(píng)分更能準(zhǔn)確地診斷及預(yù)測包括任何等級(jí)的PCa。

四、外泌體中的Myosin IC和同工型A

Myosin IC被認(rèn)為是一種非傳統(tǒng)型單頭非肌肉肌球蛋白，而分子Myosin IC的罕見同工型A的表達(dá)水平可以區(qū)分PCa的侵襲程度，并且該外泌體能夠從血液與尿液中檢測到[17]。Maly I V等人[17]通過培養(yǎng)侵襲性PCa細(xì)胞系PC3分泌的外泌體，從中發(fā)現(xiàn)了Myosin IC和同工型A，并且驚奇地發(fā)現(xiàn)Myosin IC的同工型A促進(jìn)了前列腺上皮細(xì)胞分泌外泌體，進(jìn)而增強(qiáng)其侵入細(xì)胞外基底膜的能力。該基底膜的破壞標(biāo)志著脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，并且體內(nèi)細(xì)胞對(duì)基底膜的破壞能力與PCa的轉(zhuǎn)移有關(guān)。外泌體中的Myosin IC和同工型A不僅對(duì)前列腺上皮細(xì)胞侵襲能力有直接影響，而且該分子的分泌功能還可能通過外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞重塑基質(zhì)的刺激而對(duì)腫瘤侵襲產(chǎn)生二次促進(jìn)作用；也有研究證明了這種外泌體同工型A在侵襲性PCa中特異性表達(dá)[18]。綜上說明外泌體中的Myosin IC和同工型A可以作為檢測侵襲性PCa的無創(chuàng)檢查的標(biāo)志物。

五、總結(jié)與展望

外泌體具有穩(wěn)定性、生物相容性、通透性、低毒性和低免疫原性的生物物理特性[19]，并且外泌體在腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的作用[20]，正是因?yàn)橥饷隗w的這些特點(diǎn)，讓其能夠成為診斷侵襲性PCa的天然生物標(biāo)志物。相比于前列腺穿刺活檢，外泌體不僅更準(zhǔn)確、更靈敏，而且其無創(chuàng)的特點(diǎn)對(duì)臨床醫(yī)生及患者都有重要的意義[21]。但是目前用外泌體診斷侵襲性PCa仍處于起步階段，我們依然有許多問題需要解決，如：①目前關(guān)于外泌體檢測侵襲性PCa的研究較少，需要更多的臨床研究及循證醫(yī)學(xué)來認(rèn)證。②目前對(duì)外泌體在臨床中用途的研究仍然不夠全面，需要進(jìn)一步的研究來建立外泌體的表征及操作標(biāo)準(zhǔn)。③外泌體的分離、提純一直是個(gè)難點(diǎn)，如何確定合適的劑量以獲得高度純化的外泌體也需要廣大研究人員攻克，而外泌體中各種物質(zhì)的組成和作用機(jī)理也仍然需要更深的探究。簡而言之，外泌體是用于檢測侵襲性PCa的非常有前途的工具，但其首先需要解決仍然存在的許多挑戰(zhàn)性問題。