重癥肌無力血清相關(guān)抗體致病機制研究進展

王 培， 梁文昭綜述， 徐忠信審校

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種由自身抗體介導的破壞神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)信號傳遞的自身免疫性疾病，以骨骼肌無力和易疲勞為主要臨床表現(xiàn)[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)抗AchR-Ab、MUSK-Ab等其他針對胞內(nèi)、胞外抗原的抗體通過一系列不同的機制，參與了MG致病的過程。血清抗體對MG的臨床診斷、治療、管理及預后的評估都具有重要意義，本文對MG相關(guān)抗體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、致病機制、臨床意義相關(guān)進展綜述如下。

1 NMJ的結(jié)構(gòu)及功能

NMJ是由運動神經(jīng)末梢和肌纖維特化形成的突觸結(jié)構(gòu)，包括突觸前膜、突觸間隙、突觸后膜。突觸前膜軸漿內(nèi)含充滿乙酰膽堿分子(Ach)的突觸小泡。突觸后膜由肌細胞表面特殊分化的終板構(gòu)成，分布著AchR、離子通道及與細胞骨架相關(guān)蛋白如rapsyn，utrophin和dystrophin等[3]。突觸間隙內(nèi)充滿細胞外基質(zhì)，內(nèi)含可將乙酰膽堿水解為乙酸和膽堿的乙酰膽堿酯酶(AchE)。從神經(jīng)纖維傳來的信號通過NMJ以“電-化學-電信號”的模式傳遞給肌纖維。神經(jīng)運動纖維產(chǎn)生電信號，使Ach出胞釋放至突觸間隙，并與突觸后膜AchR結(jié)合，離子通道開放后肌膜去極化產(chǎn)生終板電位，誘發(fā)Ca2+從肌漿網(wǎng)釋放，通過興奮-收縮偶聯(lián)機制使肌纖維收縮(見圖1)。AchR以團簇的形式聚集在突觸后膜肌纖維終板上，局部AchR密度增大可以增強信號傳遞[4]。其中Agrin-LRP4-MUSK信號通路誘導的AchR簇集是維持NMJ信號傳導的關(guān)鍵因素，所有靶點的損傷都可能破壞NMJ的結(jié)構(gòu)或功能，導致神經(jīng)-肌肉傳遞障礙[1]。

MUSK、agrin、LRP4是構(gòu)成NMJ必不可少的部分(見圖1)。有研究提出神經(jīng)肌肉接頭形成的過程中，在運動神經(jīng)元軸突分支到達、支配肌纖維之前，MUSK激活誘導肌纖維“預排”(pre-patterning)，在肌管中央有彌漫分布、不穩(wěn)定的“初始”的AchR簇。Agrin穩(wěn)定早期的AchR簇，錨定在基板上并與LRP4結(jié)合，誘導MUSK的二聚和自激活，進而誘導突觸前和突觸后的分化。運動神經(jīng)支配后，MUSK的表達下調(diào)，并特定固定在突觸后膜發(fā)揮作用。在神經(jīng)肌肉接頭發(fā)育成熟的過程中，NMJ增大、形態(tài)及分子組成改變，例如原始的AchR逐漸成熟(AchR的γ亞基由ε亞基替代)，突觸后膜特化，成熟的AchR以簇集的形式聚集在肌纖維終板上實現(xiàn)傳導[5，6]。還有很多蛋白及分子參與、調(diào)控該過程，如Rapsyn蛋白(receptor-associated protein of the synapse)作為一種自聚合的結(jié)構(gòu)蛋白，通過微管微絲交聯(lián)因子1 (microtubule actin cross-linking factor 1，MACF1)的介導，將AChRs與肌動蛋白(actin)細胞骨架錨定，形成成熟的簇固定到突觸后膜終板。熱休克蛋白分子伴侶Tid1s(tumorous imaginal discs1)和Rapsyn固定突觸后膜AchR簇，Tid1s還促進 DOK7-MUSK信號通路(MUSK激活過程)。此外，Wnt-MUSK(CRD)、LRP4、肌肉源性的層粘連蛋白α4、α5和β2還可通過肌肉-神經(jīng)逆行通路調(diào)節(jié)突觸前膜的功能[7，8]。

2 MG相關(guān)抗體

MG是自身抗體介導的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，根據(jù)抗原定位，可將抗體分為抗胞外(跨膜)抗原的抗體和抗胞內(nèi)抗原的抗體兩大類。所有參與NMJ信號傳遞環(huán)節(jié)的抗體均可能影響疾病。胞外(跨膜)抗體包括AchR-Ab、MUSK-Ab、LRP4-Ab、agrin-Ab、ColQ-Ab、kv1.4-Ab，胞外(跨膜)抗體主要通過直接或間接影響神經(jīng)肌肉接頭AchR功能而致病。抗胞內(nèi)抗原的抗體包括titin-Ab、RyR-Ab、Cortactin-Ab，目前暫無確切的胞內(nèi)抗體致病的直接證據(jù)，但胞內(nèi)抗體提示可能合并胸腺瘤、心臟受累、病情較重[1]，具體機制有待進一步研究。

2.1 抗乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab) AchR是NMJ突觸后膜上的跨膜糖蛋白，AchR的5個亞基中間形成離子通道[9]。突觸前膜合成并以量子的形式釋放Ach，與突觸后膜上的AchR結(jié)合，使離子通道開放鈉離子內(nèi)流、鉀離子外流，肌膜去極化產(chǎn)生微小終板電位(mEPP)，mEPP逐漸累積產(chǎn)生EPP，當EPP峰值達到閾值時誘發(fā)肌纖維產(chǎn)生動作電位，引起肌纖維收縮[4]。

AchR-Ab主要致病機制現(xiàn)階段認為主要有以下幾方面：(1)補體激活；AChR-Ab與抗原結(jié)合激活補體，膜攻擊復合物(MAC)的形成，最終導致細胞膜溶解、突觸后結(jié)構(gòu)被破壞如終板皺褶簡化、AchR減少、突觸內(nèi)碎片等，并且動物實驗發(fā)現(xiàn)補體激活是AchR-Ab病理機制的主要原因[5]。(2)抗原調(diào)節(jié)：AchR-Ab與AchR交聯(lián)(crosslink)，加速突觸后膜AchR內(nèi)化和破壞，使突觸后膜AchR減少。(3)部分抗體直接阻斷Ach結(jié)合位點，破壞傳導通路(見圖1)[1，5]。AchR-Ab按照作用機制分為結(jié)合抗體、阻斷抗體和調(diào)節(jié)抗體，相較另外兩種抗體結(jié)合抗體有診斷價值[10，11]。

2.2 抗肌肉特異性酪氨酸激酶抗體(MUSK-Ab) MUSK是突觸后膜表達的一種跨膜蛋白，MUSK細胞外區(qū)域包含三個Ig結(jié)構(gòu)域(Ig1/2/3)和一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(cysteine-rich domain，CRD)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、短的近膜區(qū)和由8個氨基酸構(gòu)成的的羧基端序列[5，12]。MUSK Ig1結(jié)構(gòu)域與LRP4結(jié)合，agrin從神經(jīng)末梢釋放后與LRP4結(jié)合，agrin與LRP4的結(jié)合也能促進MUSK-LRP4作用。Agrin-LPR4復合物與MUSK的相互作用引發(fā)了MUSK的磷酸化和活化，激活的MUSK促進突觸后膜AchRs的簇集、維持突觸后膜的結(jié)構(gòu)及功能[1，3]。為了維持MUSK的活化和刺激下游通路，DOK7作為肌肉細胞內(nèi)的銜接蛋白，與MUSK的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域作用。除agrin-LRP4-MUSK-DOK7信號通路促進MUSK激活、AchR簇集外，Wnt-MUSK(CRD)在NMJ早期神經(jīng)支配前也促進AchR聚集，即AchR的“預排”(prepatterning)[7，8]。此外MUSK還可通過AchE-ColQ復合物實現(xiàn)AchE在突觸后膜的錨定(見ColQ部分)。

MUSK-Ab主要是IgG4型，與AchR-Ab作用機制不同(兩種抗體Fc域不同)，目前研究認為，MUSK-Ab不直接激活補體也不參與抗原調(diào)節(jié)，而是通過作用于MUSK與LRP4、ColQ等蛋白的結(jié)合位點(MUSKIg1、CRD結(jié)構(gòu)域)，抑制了 MUSK激活，阻斷agrin-LRP4-MUSK信號傳遞，使突觸后膜AchRs密度減低，NMJ處傳導減少致骨骼肌無力和易疲勞[1，7]。還有一小部分抗體是IgG1-3型，MUSK-Ab IgG1-3也能減少C2C12肌管中AchR的簇集，但并不阻斷LRP4-MUSK間相互作用[5，13]。也有研究顯示，MUSK-Ab通過阻止MUSK與ColQ結(jié)合，導致AchE催化活性降低，是另一個可能的致病機制，并認為這也可能是MUSK-MG對ACEI類藥物抵抗的原因[7]。MUSK-MG病情普遍較重，且與抗體滴度相關(guān)[1]。

2.3 抗低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4抗體(LRP4-Ab) LRP4是一種跨膜蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域較大包含9個低密度脂蛋白(LDL)的結(jié)構(gòu)域、2個表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域和4個β-螺旋結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域較小，包括1個NPXY模序和與PDZ相作用的C端。LRP4第1個β-螺旋結(jié)構(gòu)域與agrin結(jié)合，第3個β-螺旋結(jié)構(gòu)域與MUSK第1個Ig結(jié)構(gòu)域結(jié)合，第3個β-螺旋結(jié)構(gòu)域的邊緣部分調(diào)節(jié)MUSK信號以及中心部分調(diào)節(jié)Wnt信號[3，5，8，14]。LRP4與agrin、MUSK形成六分子復合物在神經(jīng)肌肉接頭傳遞信號[3]。

LRP4-Ab參與MG的可能機制現(xiàn)階段研究主要考慮以下幾個方面：(1)LRP4-Ab通過直接與位點相作用或者間接作用于遠端位點改變細胞外的結(jié)構(gòu)域，進而干擾MUSK-LRP4、agrin-LRP4的相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)LRP4-MG患者血清破壞了LRP4-agrin作用[15]。(2)LRP4-Ab也可能通過交聯(lián)，誘導LRP4內(nèi)化，細胞表面的LRP4減少。(3)LRP4-Ab也可能通過補體激活損傷NMJ，目前已經(jīng)在動物實驗中得到驗證[3]。

2.4 抗集聚蛋白抗體(Agrin-Ab) Agrin是一種由運動神經(jīng)末梢釋放的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)。agrin N端包含9個卵泡抑素樣的重復序列，中心包含兩個層粘連蛋白B樣結(jié)構(gòu)域，C端包含3個層粘連蛋白G樣(LG)結(jié)構(gòu)域、4個EGF樣結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)對agrin固定在NMJ是必需的，其C端(LG3結(jié)構(gòu)域)的B/Z剪接位點中插入8個氨基酸形成的B/Z結(jié)構(gòu)區(qū)(即Z8)與LRP4構(gòu)成二聚體，這對突觸后膜AchR的聚集起重要作用[1，3，5，16]。agrin 與肌纖維膜上的蛋白結(jié)合(如LRP4、肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖、層粘連蛋白)，調(diào)節(jié)NMJ的形成、維持和再生[1]。Agrin與LRP4結(jié)合是NMJ中agrin-LRP4-MUSK信號傳遞通路的重要環(huán)節(jié)，同時agrin還能促進MUSK與LRP4間的相互作用[3]。

動物模型主動免疫agrin致病已得到證實，有研究發(fā)現(xiàn)MG患者血清能抑制C2C12肌管中agrin介導的MUSK磷酸化，提示LRP4-agrin間相互作用受阻。Agrin-Ab作用機制考慮為agrin-Ab阻止agrin與LRP4結(jié)合，NMJ信號傳遞受損，抑制MUSK磷酸化和AchR的簇集[1，5]。

2.5 抗ColQ抗體(ColQ-Ab) 膠原蛋白(Collagen)構(gòu)成細胞外基質(zhì)的骨架，是突觸間隙中突觸基底結(jié)構(gòu)的組成成分。ColQ是AchE瞄定和聚集在NMJ環(huán)節(jié)中至關(guān)重要的蛋白，ColQ瞄定、結(jié)合細胞外基質(zhì)的AchE，并被固定在突觸基底膜上。ColQ的每一條鏈都能與AchE的四聚體結(jié)合，NMJ中主要是A12型，由12個AchE亞基和3個ColQ組成[17]。ColQ的N端包含8個脯氨酸(PRAD)，N端結(jié)構(gòu)域通過催化亞基與AchE相作用，中央膠原結(jié)構(gòu)域的兩個肝素結(jié)合位點介導與perlecan蛋白(一種HSPG)結(jié)合，perlecan結(jié)合α-dystroglycan，將細胞外基質(zhì)和細胞骨架相連，C端與MUSK的Ig1和CRD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，ColQ和MuSK之間的關(guān)聯(lián)使ColQ-AChE符合突觸定位[8，17，18]。有關(guān)ColQ-Ab的病理機制的研究比較有限，ColQ-Ab可能破壞ColQ-AchE復合物濃度，減少突觸間隙AchE的數(shù)量[19，20]。有研究發(fā)現(xiàn)ColQ功能受損導致Ach在突觸間隙時間延長，終板電流的時間延長、離子流增強，最終導致終板肌病、神經(jīng)肌肉傳導受損、終板受體敏感性減低[17，19，21]。實驗小鼠缺少ColQ后AChE不再分泌，突觸間隙Ach呈高水平狀態(tài)。Sigoillot等發(fā)現(xiàn)骨骼肌、肌管ColQ敲除的小鼠，膜結(jié)合MUSK和AchR簇集均減少，在ColQ缺乏的肌管中補充ColQ后能部分恢復agrin介導下的AchR簇集[17，22]。但是Otsuka等研究發(fā)現(xiàn)，AchE-ColQ復合物能阻滯MUSK與LRP4相互作用，抑制agrin-LRP4-MUSK信號通路。因此ColQ對AchR聚集可能存在兩個相反的作用機制[23]。

2.6 抗kv1.4抗體(kv1.4-Ab) 電壓門控式鉀離子通道是由四個跨膜α-亞基構(gòu)成的四聚體，kv1.4是分子量大小約為73 KDa的α-亞基，kv1.4控制突觸前膜Ach的釋放[4，24]。Kv1.4主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中表達，也存在于外周神經(jīng)、骨骼肌和心肌中[24]。

有研究發(fā)現(xiàn)，Kv1.4-Ab在日本MG患者陽性率為11%～18%，癥狀重，可以合并心肌炎、肌無力危象、胸腺瘤等。而Kv1.4-Ab在高加索人MG患者中陽性率接近(為17%)，但這些患者癥狀相對較輕，多數(shù)僅表現(xiàn)為眼肌型[4，25]。這可能與不同種族間遺傳差異相關(guān)，例如在高加索人群中DR3與EOMG(發(fā)病年齡小于50歲)正相關(guān)，與LOMG(發(fā)病年齡大于50歲)負相關(guān)；DR7反之。而DR3與DR7在日本MG患者中罕見，取而代之的是DR9與DR2，與高加索人群中DR3和DR7有類似的關(guān)系[25，26]。

2.7 抗連接素抗體(Titin-Ab) Titin是一種位于骨骼肌和心肌肌小節(jié)內(nèi)的絲狀肌肉蛋白，大小約3000-4200kDA，是分子量最大的肌肉蛋白。但titin-Ab特異性作用于titin 30kDA區(qū)域，約占titin大小的1%(即MGT30)，MGT30靠近肌小節(jié) A/I帶交界處，是titin主要的免疫原區(qū)[4，27，28]。Titin對骨骼肌收縮起著關(guān)鍵作用，titin-Ab可能是通過表位擴展與胞內(nèi)抗原反應，影響肌肉收縮。在EOMG患者中titin-Ab對提示胸腺瘤的意義較大[27～29]。

2.8 抗蘭尼堿受體抗體(RyR-Ab) 蘭尼堿受體(RyR)是骨骼肌和心肌肌漿網(wǎng)上的Ca2+通道，RyR的四種同源性亞基中間形成一通道。RyR通過介導Ca2+從肌膜釋放到細胞質(zhì)參與興奮-收縮耦聯(lián)機制，肌膜去極化時通道開放，Ca2+從肌膜進入細胞質(zhì)，激活肌漿中的收縮蛋白、引起肌肉收縮[30，31]。RyR有兩種分型，其中RyR1型與骨骼肌相關(guān)，心肌為RyR2型，RyR-Ab能與兩種分型交叉反應[32]。關(guān)于RyR-Ab病理機制目前認為RyR-Ab作用于RyR，阻止蘭尼堿(Ryanodine)和RyR的結(jié)合，離子通道開放受阻，Ca2+釋放受限[33]。研究發(fā)現(xiàn)RyR-Ab可引起RyR功能變構(gòu)抑制。通過動物實驗發(fā)現(xiàn)RyR-Ab在體內(nèi)直接與RyR結(jié)合是肌無力的致病因素[34]。

2.9 抗皮質(zhì)蛋白抗體(Cortactin-Ab) 皮質(zhì)蛋白(Cortactin)是一種骨骼肌的胞內(nèi)微絲肌動蛋白結(jié)合蛋白，在NMJ中促進肌動蛋白(actin)的組裝和MUSK介導下的AchR簇集。Cortactin和Arp2/3蛋白復合物均在AchR簇位點富集，cortactin是酪氨酸激酶的底物，Arp2/3蛋白復合物是皮動蛋白的重要靶點，也是細胞內(nèi)actin聚合的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[35]。目前認為agrin/MUSK信號通過src(可能還有其他)酪氨酸激酶作用于cortactin，cortactin與Arp2/3復合物(可能還有Nck1、N-WASP等蛋白)共同作用，促進actin在NMJ的聚合和AchR的簇集[8，35]。研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化缺陷的cortactin突變體強制表達后，會抑制agrin誘導的AchRs簇集，通過RNA干擾降低內(nèi)源性cortactin水平也是如此[35]。

Illa等提出cortactin-Ab的免疫原理可能與抗雙載蛋白抗體(stiff person encephalomyelitis)假說類似，在神經(jīng)肌肉傳遞過程中，胞內(nèi)抗原在突觸間隙表面“短暫的兼職”(transient moonlighting)，給自身抗體一個短暫的機會窗口，抗原-抗體可以瞬時特異性結(jié)合作用[36，37]。Cortactin-Ab在健康人群和其他疾病中均有發(fā)現(xiàn)，如Lambert-Eaton肌無力綜合征，這意味著cortactin可能也在突觸前表達，并作為Wnt信號依賴的突觸前效應分子[8]。Cortactin-Ab可能對血清雙陰性的眼肌型MG患者有著重要診斷價值[36]。

NMJ由突觸前膜、突觸間隙、突觸后膜組成，Ca2+內(nèi)流誘發(fā)Ach出胞從神經(jīng)末梢釋放至突觸間隙，與突觸后膜AchR結(jié)合，離子通道開放，肌肉收縮(圖中黑色箭頭所示)。Agrin從神經(jīng)末梢釋放，在NMJ形成agrin-LRP4-MUSK信號通路，在Rapsyn蛋白等作用下促使突觸后膜AchR簇集(藍色箭頭及對話框所示)。AchR-Ab激活補體，形成MAC破壞突觸后膜；AchR-Ab與突觸后膜AchR交聯(lián)，加快AchR內(nèi)化及退化；AchR-Ab也可以直接阻斷Ach結(jié)合位點(圖中紅色對話框標注)。MUSK-Ab、LRP4-Ab、agrin-Ab作用于agrin-LRP4-MUSK信號通路影響突觸后膜AchR簇集和NMJ。Titin-Ab、RyR-Ab影響肌肉收縮。Cortactin-Ab可能與抗原瞬時結(jié)合，抑制突觸后膜AchR聚集。ColQ-Ab可能破壞ColQ-AchE復合物，影響突觸間隙AchE數(shù)量。

3 結(jié) 論

綜上，重癥肌無力是累及NMJ的自身免疫性疾病，血清抗體檢測是診斷MG的主要方式。AchR-Ab、MUSK-Ab是MG主要致病抗體且致病機制已較為明確，其余抗體的機制有待進一步研究。對于LRP4-Ab、agrin-Ab，已有研究發(fā)現(xiàn)實驗動物主動免疫抗原后產(chǎn)生抗體，并與自身抗原反應表現(xiàn)出MG樣癥狀，但還需被動轉(zhuǎn)移患者血清(抗體)至實驗動物觀察是否出現(xiàn)肌無力癥狀來進一步證實抗體致病[5]。RyR、titin、cortactin是肌肉收縮的重要蛋白，但其細胞內(nèi)定位使得自身抗體不太可能在MG中發(fā)揮直接致病的作用[4]。除上述抗體外，在MG患者血清中還發(fā)現(xiàn)有Collagen XIII-Ab、Rapsyn-Ab、AchE-Ab等抗體，但機制不清楚。此外仍有5%～10%的患者血清中未能檢測出已知的抗體(血清抗體陰性)[5]。MG是由免疫等多種因素參與的疾病，血清抗體為MG的診斷、療效、預后等方面提供依據(jù)，而MG的相關(guān)血清抗體機制的進一步研究有利于MG患者的早期診斷及精準治療。