結核分枝桿菌實驗室檢測技術的對比分析

王彧超

【摘要】目的：對比與分析結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）不同實驗室檢測技術的效果。方法：研究對象為2018年8月至2020年12月在南通瑞慈醫院住院診治的肺結核患者84例，以及同期確診患其他肺部疾病住院病例且無活動性結核病變征象的患者84例。取所有患者的痰液標本，都給予三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）發光法、涂片、PCR 檢測，記錄檢測時間與判斷檢測效果。結果：在168例患者中，痰涂片檢測與 ATP 發光法檢測的時間少于 PCR 檢測（P <0.05），痰涂片檢測時間少于 ATP 發光法檢測（P <0.05）。以痰培養結果為金標準，痰涂片檢測、ATP 發光法檢測、PCR 檢測的敏感性分別為79.76%（67/84）、91.67%（77/84）、98.81%（83/84），特異性分別為88.10%（74/84）、89.29%（75/84）和100.00%（84/84），對比差異有統計學意義（P <0.05）。結論：相對于痰涂片檢查、ATP 發光法檢測， PCR 技術在結核分枝桿菌實驗室檢測中耗費時間相對長，但是檢測的敏感性與特異性更高，有很好的應用價值。

【關鍵詞】肺結核;結核分枝桿菌;實驗室檢測技術; PCR 技術;三磷酸腺苷發光法;痰涂片法

【中圖分類號】R521 R446.5【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-5249（2021）22-0181-02

當前結核病依然為一種嚴重的公共衛生問題疾病，如果結核患者能夠得到早期的診斷及接受正確的治療，就可以有效改善患者預后，也可有效預防和控制結核病造成的傷害[1]。結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起結核病的重要病原體，其可導致全身各個器官的慢性病理性改變，包括肺內器官與肺外器官等[2]。痰培養法為結核分枝桿菌的診斷金標準，也可在改良羅氏固體培養及在其基礎上進行菌種鑒定與藥敏時間。但是其耗費時間比較長，也很難區分活菌與死菌，有時候可延誤患者獲取正確治療的最佳時機而錯失改善預后的機會。痰涂片鏡檢對于技術人員的要求比較高，有一定的主觀性，診斷的特異性有待提高。抗原檢測具有操作方便、檢測快速等特點，其中三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）發光法是依據活細菌體內均含有一定量的ATP，利用 ATP與熒光素酶的反應，通過熒光強度來間接反映判斷ATP 的含量，從而可以判斷細菌活力[3-4]。隨著檢測技術的發展，當前PCR技術得到了廣泛應用，特別是 qPCR 技術的熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環情況[5]。本文對比了上述三種實驗室方法檢測結核分枝桿菌的效果，希望為臨床上合理選擇檢測技術提供參考。現報道如下。

1對象與方法

1.1研究對象

研究對象為2018年8月到2020年12月在南通瑞慈醫院住院診治的肺結核患者84例，以及同期確診患其他肺部疾病住院病例且無活動性結核病變征象的患者84例。168例患者中，男性86例，女性82例，年齡（49.27±2.58）歲，體重指數（24.77±1.86）kg/m2，心率（85.20±3.75）次/分，空腹血糖（5.14±0.46）mmol/L。

納入標準：年齡20～80歲;肺結核患者都明確診斷為活動性肺結核（痰液改良羅氏固體培養基培養陽性）;其他肺部疾病患者X線胸片檢查無活動性結核病變（痰液改良羅氏固體培養基培養陰性）;臨床資料完整;患者簽署了知情同意書;采樣檢測前所有患者都給未予任何治療。

排除標準：妊娠與哺乳期婦女;合并非肺部惡性腫瘤者;臨床資料缺乏者;合并其他呼吸道傳染性疾病者;具有新型冠狀病毒肺炎密切接觸史的患者。

1.2檢測方法

（1）痰涂片檢測。取所有患者深喉痰液，取標本中的干酪樣、膿樣與可逆部分，于干凈脫脂玻片涂抹成卵圓形痰膜，然后進行痰涂片鏡檢，取×300視野，出現≥2條桿菌數量判斷為結核分枝桿菌陽性。

（2）ATP發光法檢測。取患者的痰液樣本，在生物安全柜內進行漩渦振蕩混勻，混合ATP蟲熒光素酶凍干粉與裂解液，制成ATP酶液。吸入20μL樣本中于ATP小試管中，加入100μLATP酶液進行發光值測量，熒光讀數比初始讀數≥2倍判定為陽性，嚴格按照操作羅氏公司的操作說明書進行操作。

（3）PCR檢測。取患者的痰液標本后，充分勻化使痰液，2000 rpm離心5 min，取下層沉淀提取基因組，采用 qPCR 檢測結核分枝桿菌保守序列16sRNA 的表達情況，檢測體系為25μL，其中樣本基因組量為5μL。正向引物為5‘-CCCTAGACCGGAACTCGGGAATTTT-3’，反向引物為5 ‘-AAGCCTGGACCACAAGACATTAGGGCC-3’， Ct 值≥35判斷為陽性， Ct值<40為陰性，檢測結果處于兩者之間的痰標本需重新檢測，重檢后若Ct值<40判定為陽性。

1.3觀察指標

（1）觀察與記錄所有患者的檢測時間。（2）以痰培養結果為金標準，觀察與記錄所有患者的檢測敏感性與特異性，計算方式為敏感性=真陽例數/（真陽例數+假陰例數）×100%，特異性=真陰例數/（真陰例數+假陽例數）×100%。

1.4統計學方法

采用 SPSS 19.0，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用 t 檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2結果

2.1檢測時間對比

在168例患者中，痰涂片檢測與ATP 發光法檢測的時間少于 PCR 檢測（P<0.05），痰涂片檢測時間少于ATP 發光法檢測（P<0.05），見表1。

2.2檢測效果對比

以痰培養結果為金標準，痰涂片檢測、 ATP 發光法檢測、 PCR檢測的敏感性分別為79.76%（67/84）、91.67%（77/84）、98.81%（83/84），特異性分別為88.10%（74/84）、89.29%（75/84）和100.00%（84/84），對比差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

3討論

結核分枝桿菌為聚集成分枝狀排列繁殖，無菌毛、鞭毛和莢膜，菌體細長略彎曲，抗酸染色陽性，不形成芽孢。結核分枝桿菌為導致肺結核的主要病原體，也可侵犯全身各器官[6]。同時是由于各種因素的影響，當前耐藥肺結核患者越來越多，一些患者經過長期正規治療后結核病灶沒有吸收甚至病灶播散、痰菌量沒有減少，為此加強早期診斷具有重要價值[7]。痰培養不僅是臨床確診肺結核的金標準，也是判斷結核分枝桿菌陽性的重要標準。但是結核分枝桿菌的增殖比較緩慢，在臨床檢測中常無法及時提供檢測報告。痰涂片檢查具有操作簡便、快速等特點，但是其檢出陽性率低，不能鑒定細菌的活力，容易造成誤診與漏診。ATP發光法是采用免疫層析原理進行測定，可為活動性肺結核的診斷提供直接的證據，也具有操作方便、快速有效等優勢。有研究顯示，熒光檢測的強度與被測樣品中結核分枝桿菌增殖產生的ATP 含量成正比，為此可判斷結核分枝桿菌的生長情況[8]。本研究顯示，在168例患者中，痰涂片檢測與ATP 發光法檢測的時間少于 PCR 檢測（P<0.05），痰涂片檢測時間少于ATP 發光法檢測（P<0.05），但是都少于1d。從機制上分析， qPCR 方法采用的熒光探針序列是針對結核分枝桿菌菌群特異性核酸序列而設計，采用了熒光標記的探針實時監測擴增過程中的熒光信號，能夠有效的控制污染問題及有效減少假陰性結果。

肺結核的臨床診斷是建立在臨床癥狀、影像學檢查、實驗室檢測、病理檢測等多方面綜合診斷的基礎之上，痰培養檢測為金標準，但是檢測的時間比較長。ATP發光法是當前比較常見微生物檢測技術之一，也能判斷結核分枝桿菌的耐藥情況，有利于臨床用藥的及時調整。不過自然界中所有微生物體內均含有一定量的ATP，ATP與熒光素酶混合后能產生熒光，會產生一定的漏診情況。本研究采用的PCR檢測融入了熒光標記的檢測探針，實現了擴增過程的實時監測，可使RNA擴增產物的檢測與擴增過程同步化，簡化了操作過程，有利于提高診斷的效果與質量[9-11]。本研究顯示，以痰培養結果為金標準，痰涂片檢測、 ATP 發光法檢測、PCR檢測的敏感性分別為79.76%、91.67%、98.81%，特異性分別為88.10%、89.29%和100.00%，對比差異有統計學意義（P<0.05），表明 PCR檢測具有更高的檢測敏感性與特異性。本研究也存在一定的不足，沒有納入正常健康人群，涉及對比的檢測方法也比較少，將在后續研究中進行探討。

綜上所述，相對于痰涂片檢查、 ATP發光法檢測， PCR 技術在結核分枝桿菌實驗室檢測中耗費時間相對長，但是檢測的敏感性與特異性更高，有很好的應用價值。

參考文獻

[1] 林建，趙永，戴志松，等.福建省261株非結核分枝桿菌的菌種鑒定分析[J].中國防癆雜志，2021，43（6）：590-595.

[2] 王智慧，董雅坤，池躍朋，等.熒光 PCR 探針熔解曲線法檢測老年肺結核患者耐藥性的價值[J].結核病與肺部健康雜志，2021，2（1）：18-22.

[3] 段惠娟，褚洪遷，孔成成，等.11種結核分枝桿菌抗原皮膚試驗反應效果評價[J].中國防癆雜志，2021，43（3）：255-260.

[4] 郁晨蕾，江淵，李靜，等細菌超聲分散計數儀在結核分枝桿菌最小抑菌濃度檢測中的應用[J].檢驗醫學，2021，36（6）：650-655.

[5] 魯瑤，趙麗麗，李馬超，等.RPA-LFD 技術快速檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性的應用[J].中國人獸共患病學報，2021，37（5）：387-391.

[6] 張匯征，李桓，張珍，等.熒光 PCR 熔解曲線法在檢測臨床標本結核分枝桿菌及其耐藥性中的應用[J].中國實驗診斷學，2021，25（3）：354-356.

[7] 李遠春，張越，曾祥潔，等.胞內分枝桿菌臨床分離株亞種組成及體外耐藥性分析[J].中國防癆雜志，2021，43（2）：147-152.

[8] 喬敏，李姍姍，劉榮梅，等.CC 趨化因子和 CXC 趨化因子及其受體在結核分枝桿菌感染免疫應答中作用的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志，2021，37（4）：373-377.

[9] 劉新華，何浩嵐，張春蘭，等.老年人結核分枝桿菌培養陽性的HIV/AIDS 患者臨床特征[J].熱帶醫學雜志，2021，21（2）：230-233.

[10]胡彥（綜述），陳娟娟，王小中（審校）.結核分枝桿菌實驗室診斷方法及評價[J].實驗與檢驗醫學，2016，34（2）：177-179.

[11]張薇，趙立.結核分枝桿菌感染的實驗室診斷方法及檢測技術研究進展[J].國際呼吸雜志，2019，39（20）：1586-1591.

（收稿日期：2021-03-27）