抗菌肽PAF26對采后李果實褐腐菌的抑菌效果及機理

蔡 蜨，李心丹，鄧麗莉,3，曾凱芳,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（西南大學），重慶 400715；3.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

李子是薔薇科植物李的果實，我國大部分地區均產[1]。李果實成熟于夏季高溫季節[2-3]，是一種高度易腐、采后壽命短的農產品[4]。李果實采后腐爛造成了重大的經濟損失[5]，其中，較為嚴重的是褐腐病，且主要致病菌是美澳型核果鏈核盤菌（Monilinia fructicola（Winter）Honey）[6]。核桃腐病菌（M.fructicola）具有很快的生長速度和傳播速度[7-8]，病原體會感染田間的花、嫩枝和果實，并產生包括花苞凋謝、木質組織潰爛和果實腐爛等各種癥狀，普遍的損害發生在貯藏和運輸的采后階段[9]。在現有的李果實褐腐病的防治中，化學殺菌劑的使用是最普遍、也是最有效的，如過氧乙酸[3]、1-甲基環丙烯、戊唑醇[10]和L-半胱氨酸[5]處理等。但化學殺菌劑的長期使用會導致病原菌產生一定的抗性，且化學殺菌劑本身會給環境和人體健康帶來潛在威脅，因此研究者們開始致力于尋找環保、無污染、安全有效的物質來減少或代替化學殺菌劑的大量使用。

抗菌肽又可稱為抗微生物肽，一般是指由生物有機體產生的一種具有較廣抗菌譜或防御功能的小分子肽類物質[11-12]，可以非特異性地抗細菌、真菌、病毒等病原體[13]。抗菌肽可通過與細胞內靶標的特異性結合，干擾細胞代謝從而達到滅菌和殺菌的效果[14]。除此之外，抗菌肽也能通過改變細胞膜的通透性使細胞死亡[15]。近年來，抗菌肽具有的作用快速、安全、無殘留以及不耐藥等特點使其在醫藥業、食品工業、畜牧業等領域受到越來越多的關注[15-16]。抗菌肽PAF26（Ac-RKKWFW-NH2）是一種針對植物病原青霉病被組合、篩選、鑒定出的富含色氨酸的陽離子小分子合成六肽，與其他天然或合成來源的抗微生物肽具有序列相似性[17-20]。目前國外已有研究表明，PAF26能夠有效對柑橘類水果病害進行控制[21-22]，但有關PAF26在其他果蔬采后病害控制方面鮮有報道，也鮮見將抗菌肽PAF26應用于李果實采后病害控制的有關報道。本實驗旨在探究抗菌肽PAF26對李果實采后褐腐病病原菌M.fructicola的抑菌效果和作用機理，從而拓寬抗菌肽PAF26的應用范圍，并且為李果實采后病害的控制提供一種新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

M.fructicola為本實驗室自行分離、鑒定和保存的菌種。使用前將菌懸液接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基，并于25 ℃條件下培養。5 d后挑選生長旺盛的菌絲再次接種在PDA培養基，于25 ℃下培養7 d。在無菌條件下，用無菌水將M.fructicola洗下配制成高濃度的孢子懸浮液，并根據需要用無菌水調至到所需濃度，現配現用。

‘青脆李’（Prunus salicinaLindell cv.‘Qingcui’）采摘于重慶市巫山縣，采摘后當天運回實驗室。挑選無病害、無機械傷且大小均勻、成熟度一致的果實。攤平去除田間熱后，于室溫條件下貯藏待用。

純度大于90%的抗真菌肽PAF26（Ac-RKKWFWNH2）（固相合成方法合成）購于南京金斯瑞公司，貯藏在-40 ℃冰箱中，使用前先用無菌水配成4 mmol/L的母液，然后稀釋至所需濃度。SYTOX Green（SG）熒光染色劑 美國Invitrogen 公司。

1.2 儀器與設備

立式自動壓力蒸汽滅菌鍋 重慶思美特科技有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；SYNERGYH1MG全自動酶標儀 美國BioTek公司；TS100熒光顯微鏡 北京長恒榮創科技有限公司；AvantiTMJ-30I高速冷凍離心機 美國Beckman公司；DDS-307A電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽PAF26對M.fructicola的離體抑菌作用分析

實驗參考Wang Wenjun等[23]的方法并進行一定修改。使用無菌96 孔微量板進行實驗，將180 μL 1×104CFU/mLM.fructicola孢子懸浮液（含體積分數5%馬鈴薯葡萄糖液體培養基（potato dextrose broth，PDB）與20 μL抗菌肽PAF26溶液，混合后立即加入96 孔板中，使PAF26的終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L和128 μmol/L。對照組以無菌水代替抗菌肽，置于25 ℃恒溫培養箱中培養，48 h時用酶標儀測定其OD600nm。以48 h依舊能完全抑制病原菌生長的最低濃度作為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

將180 μL無菌水稀釋的M.fructicola孢子懸浮液（1×103CFU/mL）和20 μL已測出的具有抑菌濃度的抗菌肽（實驗組）或無菌水（對照組）在1.5 mL的離心管中混合。置于25 ℃恒溫培養箱中培養，16 h后從離心管中吸取50 μL液體涂布在PDA培養基上，于25 ℃繼續培養48 h，通過計數菌落形成單位（CFU）來確定分生孢子的生存能力。將抗菌肽PAF26處理后的分生孢子存活率與對照組進行比較。按公式（1）計算分生孢子存活率。每一濃度3 組平行，實驗重復3 次。

1.3.2 同孔損傷接種抗菌肽PAF26對李果實褐腐菌的控制效果實驗

實驗參考Mu?oz等[24]的方法并進行一定修改。用體積分數2%次氯酸鈉浸泡李果實1 min后用清水沖洗，并于常溫下自然晾干。果實表面赤道部位經體積分數75%乙醇溶液擦拭消毒后，將其隨機分成3 組，每組15 個果實。用滅菌鐵釘在果實赤道部位等距打兩個孔（深3 mm、直徑3 mm）。將10 μL新鮮孢子懸浮液（1×104CFU/mL）和10 μL抗菌肽混合后立即接種于孔中。以無菌水代替抗菌肽為對照使抗菌肽PAF26的終濃度為64、128 μmol/L。待液體完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋將果實單果包裝，置于25 ℃、相對濕度為80%～90%的環境中貯藏，統計第3～6天的發病率并測量病斑直徑。實驗重復3 次。

1.3.3 抗菌肽對M.fructicola細胞結構的影響

1.3.3.1M.fructicola菌絲細胞膜完整性的測定

實驗參考Wang Wenjun等[23,25]的方法并進行一定修改。用體積分數為5%的PDB配制1×104CFU/mL的病原菌孢子懸浮液，取90 μL加入到無菌的1.5 mL的離心管中，25 ℃下培養24 h。然后，加入10 μL抗菌肽溶液或無菌水（對照組），使抗菌肽PAF26的終濃度達到0、64、128 μmol/L，繼續培養2 h后加入4 μmol/L SG貯備溶液，使其終濃度達到0.2 μmol/L，樣品繼續在暗環境下培養5 min后，挑取菌絲制片并在熒光顯微鏡下觀察，條件設置：SG的檢測激發波長450～490 nm、發射波長515～565 nm；濾光片選擇為異硫氰酸熒光素。實驗重復3 次。

1.3.3.2M.fructicola孢子細胞膜完整性的測定

實驗參考Li Xindan等[26]的方法并進行一定修改。將90 μL的1×107CFU/mL的病原菌孢子懸浮液加入到無菌的1.5 mL離心管中，然后加入10 μL抗菌肽，使抗菌肽在混合液中的終濃度分別達到0、64、128 μmol/L，以無菌水代替抗菌肽為對照，置于25 ℃環境中培養6 h，加入500 mg/L的碘化丙啶（propidium iodide，PI）貯備溶液，使混合液中PI的終質量濃度達到50 mg/L，制片并在熒光顯微鏡下觀察，實驗重復3 次。熒光顯微鏡下檢測并拍照：PI的檢測（激發波長設置為535 nm、發射波長為615 nm）；濾光片選擇G-2A。每張載玻片隨機選擇5 個視野，在明視野以及相同位置的熒光視野下分別拍照記錄。將明視野中觀察到的孢子數定義為總數（T），熒光視野下觀察到紅色的染色孢子作為已被破壞膜結構的孢子數（S）。按照公式（2）計算孢子細胞膜完整性。

1.3.3.3M.fructicola菌絲體胞外電導率的測定

實驗參考Paul等[27]的方法并進行一定的修改。采用DDS-307A電導率儀測定M.fructicola胞外電導率。將100 μL 1×105CFU/mL病原菌孢子懸浮液加入到20 mL PDB培養基中，在25 ℃下160 r/min振蕩培養48 h。將培養48 h且含菌絲體的PDB培養基在4 000×g的條件下離心15 min，獲得的菌絲體沉淀再在相同離心條件下用無菌水離心沖洗3 次。收集菌絲體沉淀，重懸于無菌水中。加入抗菌肽溶液，使其終濃度分別為0、64、128 μmol/L，以無菌水代替抗菌肽溶液為對照。在處理0、0.5、1、2、3、6 h和9 h 時測定胞外電導率。每一濃度3 組平行，實驗重復3 次。

1.3.4 抗菌肽PAF26溶血性測定

實驗參考Mu?oz等[28]的方法并進行一定修改。將從西南大學南區校醫院獲得的健康成人新鮮血液混合到含有抗凝血劑的離心管中，1 000×g離心5 min，棄上清液，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3 次，然后用4 倍體積PBS重懸，獲得紅細胞懸浮液。取10 μL濃度分別64、128 μmol/L的抗菌肽溶液或0.1 mol/L PBS（陰性對照）、0.1% Triton X-100（陽性對照），與90 μL紅細胞懸浮液混合后于37 ℃培養1 h。然后1 000×g離心5 min。轉移上清液至無菌的96 孔微量板，用酶標儀測定540 nm波長處的OD值。每一濃度3 組平行，實驗重復3 次，按照公式（3）計算溶血率。

1.4 數據處理與分析

所有數據用Excel 2010軟件進行統計，運用GraphPad Prism 8軟件繪圖；用SPSS 25.0軟件對數據進行單因素方差分析，利用Duncan’s多重比較對差異顯著性進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽PAF26對M.fructicola的離體抑菌作用

由圖1A可知，當PAF26的濃度為64 μoml/L時，M.fructicola生長完全受抑制，即抗菌肽PAF26的MIC為64 μmol/L。由圖1B、C可知，與對照相比，濃度為64、128 μmol/L的抗菌肽能夠顯著降低分生孢子存活率（P＜0.05），且64 μmol//L PAF26降低M.fructicola孢子存活率的能力顯著強于128 μmol/L PAF26（P＜0.05）。

圖1 抗菌肽PAF26對M.fructicola的離體抑菌作用Fig.1 Antifungal activity in vitro of peptide PAF26 on M.fructicola

2.2 抗菌肽PAF26對李果實褐腐菌的控制效果

如圖2A所示，經同孔損傷接種后，處理3～6 d內，PAF26處理過的果實發病率顯著低于對照組（P＜0.05），且64 μmol/L處理明顯比128 μmol/L處理效果好。如圖2B所示，處理的第3、4、6天，PAF26處理過的果實病斑直徑與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。但在處理第5天時，64 μmol/L處理過的果實病斑直徑顯著小于對照組（P＜0.05）。如圖2C所示，處理6 d后，經64、128 μmol/L抗菌肽處理后的李果實發病孔數明顯少于對照組，而病斑直徑無明顯差別，與發病率和病斑直徑的測定結果一致。

圖2 抗菌肽PAF26對李果實采后褐腐菌發病率和病斑直徑的影響Fig.2 Effect of peptide PAF26 on disease incidence and lesion diameter of plum fruit caused by M.fructicola

2.3 抗菌肽PAF26對M.fructicola菌絲細胞膜的影響

圖3 抗菌肽PAF26對M.fructicola菌絲體細胞膜的影響Fig.3 Effect of peptide PAF26 on membrane permeability of M.fructicola mycelia

當細胞膜通透性被破壞后，SG熒光染色劑可進入細胞內與核酸物質結合，呈現出大于未結合核酸物質時500 倍強度的綠色熒光。如圖3所示，未經PAF26處理的對照組的M.fructicola菌絲經SG染色后，沒有出現明顯的綠色熒光；經過濃度為64、128 μmol/L的抗菌肽處理過后的實驗組，呈現出明顯的綠色熒光。表明經抗菌肽處理后的M.fructicola菌絲細胞膜已被破壞。

2.4 抗菌肽PAF26處理對M.fructicola孢子細胞膜完整性的影響

圖4 抗菌肽PAF26處理對M.fructicola孢子細胞膜的影響Fig.4 Effect of peptide PAF26 treatment on membrane permeability of M.fructicola spores

圖5 抗菌肽PAF26處理對M.fructicola孢子細胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of peptide PAF26 treatment on membrane integrity of M.fructicola spores

當M.fructicola孢子細胞膜破損后，PI熒光染色劑可進入細胞內與核酸物質結合，發出紅光。由圖4可知，對照組并未發現發出紅光的細胞，經濃度為64、128 μmol/L的抗PAF26菌肽處理后，均發現發出紅光的細胞。且由圖5可知，對照組的M.fructicola孢子細胞膜完整性基本保持在100%，而經過64、128 μmol/L PAF26處理后M.fructicola孢子細胞膜完整性均降低至85%左右，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

2.5 抗菌肽PAF26對M.fructicola菌絲體胞外電導率的影響

如圖6所示，隨著處理時間的延長，對照組和PAF26的兩個不同濃度處理組的M.fructicola菌絲體胞外電導率都逐漸增大。且經兩個不同濃度的PAF26處理后胞外電導率均顯著高于對照組（P＜0.05）。在處理9 h后，對照和64、128 μmol/L PAF26處理組胞外電導率達到最大，分別為51.60 μS/cm和63.50、89.03 μS/cm。

圖6 抗菌肽PAF26對M.fructicola菌絲體胞外電導率的影響Fig.6 Effect of peptide PAF26 treatment on extracellular conductivity of M.fructicola mycelia

2.6 抗菌肽PAF26溶血性實驗結果

圖7 抗菌肽PAF26的溶血性Fig.7 Hemolytic activity of peptide PAF26

實驗以0.1 mol/L PBS作為陰性對照，不會導致溶血現象發生，以0.1% Triton X-100作為陽性對照，有極強的溶血性。如圖7所示，兩個濃度的抗菌肽PAF26的溶血率均顯著低于0.1% Triton X-100（P＜0.05），且128 μmol/L PAF26溶血率顯著低于64 μmol/L PAF26（P＜0.05）。當PAF26濃度為64、128 μmol/L時，溶血率分別為1.62%、0.96%。

3 討 論

本實驗以探究抗菌肽PAF26對李果實采后褐腐菌的抑菌效果為目的，進而研究PAF26的作用機理。結果表明，抗菌肽PAF26在離體條件下對李果實褐腐病病原菌M.fructicola具有一定的抑菌效果，其中MIC為64 μmol/L，該濃度下能夠顯著降低孢子存活率，但不能完全殺菌，這與LfcinB20-25的作用效果[29]相似。不同濃度PAF26的抑菌效果表現出差異，但濃度增到128 μmol/L后抑菌效果反而沒有64 μmol/L好，這與乳鐵蛋白原肽的抑菌效果[29]相似。這樣的結果很有可能是因為肽的濃度存在有效范圍。在果實的同孔接種實驗中發現，PAF26能夠顯著抑制李果實M.fructicola導致的發病率，但對病斑直徑影響不大。這與前人發現抗菌肽PAF26具有一定的抗真菌活性，能在體外特異性靶向和抑制絲狀真菌的結果[17,30]相似。

通過熒光顯微鏡觀察，發現抗菌肽PAF26能夠增加M.fructicola菌絲體細胞膜的通透性，使SG進入細胞內，發出強烈的綠色熒光，這一結果與前人所描述的抗菌肽可通過破壞細胞膜通透性從而達到抑菌和殺菌效果的結論[31]相似。通過熒光顯微鏡觀察，還發現PAF26處理可破壞M.fructicola孢子細胞膜，使PI染色劑進入孢子內與核酸物質結合，發出紅光，從而延緩M.fructicola孢子的萌發，這與前人所研究的抗菌肽O3RT和C12O3TR可引起細胞滲透平衡的破壞，最終導致細胞死亡的作用機理[26]相似。細胞膜是防止細胞外物質自由進入細胞的屏障，它保證了細胞內環境的相對穩定。細胞損傷的早期表現[6]表明當其通透性發生異常變化時，會導致細胞內含物大量泄漏從而影響細胞的正常生理活性。抗菌肽PAF26處理可顯著增加菌絲體胞外電導率，促使其菌絲體膜內物質泄漏，這一結果表明菌絲體細胞膜在一定程度上受到破壞，這與PAF56[23]、BP21[25]的作用效果相似。由于某些天然抗菌肽存在抗菌活性不高、會對宿主細胞產生一定的毒性和溶血性等缺陷[32-33]，在一定程度上限制了抗菌肽的應用。但本研究表明，抗菌肽PAF26具有特異性細胞溶解活性，對人血紅細胞幾乎不存在溶解性，具有潛在的應用價值。這與PAF26溶血性結果[28]相似。

綜上，抗菌肽PAF26可以通過增加M.fructicola菌絲細胞膜通透性和破壞M.fructicola孢子細胞膜，引起胞內物質泄漏，從而達到對M.fructicola生長的抑制。PAF26幾乎不存在溶血現象，是一種比較環保、高效的抗菌肽。因此認為，抗菌肽PAF26在李果實采后褐腐菌的抑制方面具有很大的開發應用價值。