低頻高強度超聲波對雞胸肉肌原纖維蛋白性質的影響

李 可，李三影，扶 磊，趙穎穎，張艷艷，趙電波，白艷紅*

（鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

超聲波技術是一種綠色的食品物理加工技術。基于低頻率高強度超聲波（頻率20～100 kHz、強度＞1 W/cm2）處理下改善各種食品蛋白質功能特性（溶解性、保水性、凝膠特性、乳化特性、起泡性等）的研究成為食品物理加工技術領域的熱點[1-2]。高強度超聲波通過“空化效應”產生機械、化學、熱作用等，引起植物蛋白、畜禽蛋白和水產品蛋白結構性質的改變[3-5]。一方面，近幾年國內外學者已關注不同超聲波處理條件（功率、時間、頻率等）對畜禽肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）功能特性和理化性質的影響[6-10]。但是，不同研究報道關注的重點影響性質不同，如溶解性[11]、保水性[12-13]、流變特性[14]、凝膠特性[15]以及乳化特性[16]等。本課題組前期研究發現超聲波處理（頻率20 kHz、功率450 W、時間6 min）能夠降低雞肉MP粒徑，有效改善雞肉MP的乳化活性和乳化穩定性，提高乳化液的粒徑分布均勻性和動態流變學特性[17]。同時，部分研究進一步關注不同超聲波參數處理后蛋白質二級、三級結構或分子間化學作用力、流變學特性的變化以探明改善蛋白質功能特性的機制。另一方面，應用低頻高強度超聲波可以改善新鮮肉和加工肉類的感官品質、物理化學特性和優化加工工藝，降低食鹽、磷酸鹽添加量等[18-21]。最近，Barekat等[22]發現采用超聲波嫩化牛背最長肌肉時，牛肉肌原纖維蛋白乳化能力得以增強。Cichoski[23]和Pinton[24]等參考了本課題組前期研究的超聲波參數[25]，應用超聲波處理改善了豬肉糜乳化體系的品質特性。MP是肌肉中的主要蛋白質，約占蛋白總量的50%～60%，對肉類總乳化能力的發展起著90%以上的作用[17]。因此，針對MP乳化特性方面，有必要進一步探討超聲波技術對MP乳化性能和蛋白性質的影響，揭示超聲波處理改善肌肉加工保水、保油性能的機制。

關于超聲波對畜禽MP的電位、油-水界面張力、乳化液穩定性指數的影響鮮有報道，不同超聲波處理條件下，蛋白質性質改變效果不同。另外，原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）是一種新型檢測物質結構分析儀器，具有分辨率高、標本制備方便和操作簡單等優點，因而Gao Ruichang等[26]應用AFM觀察了組氨酸對大頭魚肌球蛋白的熱誘導凝膠聚集結構。然而，應用AFM觀察超聲波處理對肌原纖維結構影響鮮見研究報道。

因此，本實驗提取雞胸肉MP，在低頻高強度超聲波不同時間處理下，研究MP的Turbiscan穩定性指數（Turbiscan stability index，TSI）、靜態流變學性質、溶解性、電位以及結構變化，分析肌原纖維組成變化，探討超聲波對雞肉MP性質的影響，以期為超聲波在乳化型制品中的應用提供理論參考與指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞胸肉購于鄭州丹尼斯超市。剔除雞肉中結締組織及多余脂肪，然后用真空包裝袋分裝，每袋200 g，真空包裝后儲存于-20 ℃，貯藏時間不超過2 周。

大豆油 益海嘉里金龍魚糧油食品有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸 北京華邁科生物技術有限責任公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上海源葉生物有限公司；牛血清白蛋白（純度98%）美國Sigma公司；所用試劑純度均為分析純及以上。

1.2 儀器與設備

SZ-22A絞肉機 廣州旭眾食品機械有限公司；T25高速攪拌器 德國IKA公司；VC750超聲波破碎儀美國Sonic公司；TU-1810紫外分光光度計 北京通用儀器有限公司；F-7000熒光光度計 日本日立公司；Discovery流變儀 美國TA儀器公司；Nano-ZS90納米激光粒度儀 英國馬爾文儀器公司；凝膠成像儀美國伯樂公司；Chirascan圓二色光譜儀 英國應用光學物理公司；Turbiscan LabMeasuringExpert多重光散射儀 法國Formulaction儀器公司；NanoManVS型原子力顯微鏡 美國布魯克公司；K100自動界面張力儀德國Krüss公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參考Zhao Yingying等[27]的方法提取。將雞胸肉于4 ℃解凍12 h，切成l～2 cm小塊，3 000 r/min絞碎15 s，重復4 次。0～4 ℃條件下提取MP。均勻絞碎的雞胸肉與分離緩沖液（10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4、0.1 mol/L NaCl、20 mmol/L MgCl2、10 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 7.0）按質量體積比1∶4均勻混合，6 000 r/min轉速下均質3 次，每次30 s；混合物用20 目篩網（孔徑0.9 mm）過濾后，2 000×g離心15 min，收集沉淀物質，相同的步驟再重復兩次，得到MP沉淀。將沉淀物按質量體積比1∶4均勻分散在0.1 mol/L NaCl溶液中，2 000×g離心15 min，重復相同步驟兩次，得到純化的MP。MP質量濃度測定采用雙縮脲法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。MP于4 ℃保存。

1.3.2 低頻高強度超聲波處理

將上述提取的MP用磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L NaCl、20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0，下同）配成質量濃度為10 mg/mL的MP溶液，取70 mL溶液于100 mL的小燒杯中，將燒杯放入超聲波破碎室進行超聲處理。直徑13 mm的超聲波探頭放入MP溶液液面下25 mm處，超聲波參數為：頻率20 kHz、功率450 W；工作模式：超聲2 s，停止4 s，超聲波處理累加時間為0、3 min和6 min。利用冰水浴控制所有樣品最終溫度低于8 ℃。參考Jambrak等[28]方法測定，超聲波強度為（30.26±2.73）W/cm2。

1.3.3 MP乳液TSI的測定

將10 mg/mL MP溶液與大豆油按質量體積比4∶1在燒杯內混合，利用碎冰對燒杯進行降溫，在高速攪拌器的作用下進行均質制備乳液，條件為：轉速10 000 r/min、均質時間30 s、間隔30 s、均質3 次、溫度4 ℃。TSI測定方法參考Wang Keliang等[29]，取20 mL的乳液于專用的玻璃瓶中，置于Turbiscan LABExpert多重光散射儀中進行穩定性分析測試。每隔30 s掃描一次，掃描時間30 min、溫度25 ℃。利用Turbiscan軟件處理可得出樣品的TSI。

1.3.4 界面張力的測定

參考O’Sullivan等[3]的方法，稍加修改。采用鉑金平板法測定水相（質量分數0.1% MP溶液）和油相（大豆油）之間的界面張力。將裝有20 g水相的玻璃皿放入儀器中，使鉑金板浸入20 g水相中至3 mm的深度。然后在水相上移入50 g油，在水相和油相之間形成界面。使用K100自動界面張力儀測定界面張力，測試進行2 400 s，整個過程中溫度保持在25 ℃。

1.3.5 MP黏度的測定

參考趙穎穎等[30]的方法，并適當修改。采用流變儀測定黏度。取3 mL稀釋的蛋白溶液樣品均勻涂布于測試平臺，用硅膠油密封，防止樣品中的水分蒸發。測試參數：測試溫度25 ℃、夾縫間隙1 mm、剪切速率1～200 s-1。

1.3.6 MP溶解度、濁度和ζ電位測定

MP的溶解度參考Zhang Ziye等[13]的方法進行測定，用磷酸鹽緩沖液將處理后的MP樣品質量濃度稀釋至1 mg/mL，然后10 000×g、4 ℃下離心20 min，用雙縮脲法測定上清液中蛋白質量濃度。溶解度表示為上清液中蛋白質量濃度占樣品質量濃度的比例。

濁度測定參考Li Ke等[31]的方法，測定1 mg/mL的MP溶液在350 nm和660 nm波長處的吸光度，以磷酸鹽緩沖液為空白。

將處理后的MP溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至1 mg/mL，用Nano-ZS90型電位/激光粒度儀測定MP的ζ電位。

1.3.7 MP的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）樣品配制：配制蛋白質量濃度為2 mg/mL的樣液，與上樣緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl、體積分數20%甘油、質量分數10% SDS，體積分數10%β-巰基乙醇和質量分數2%溴酚藍）按體積比1∶1混合，振蕩1 min，100 ℃水浴5 min，備用。電泳條件：分離膠質量分數10%，濃縮膠質量分數4%，電泳上樣量為10 μL，電泳總時間約2 h，前沿線進入分離膠之間采用電壓為60 V，進入分離膠之后電壓為110 V至電泳結束。電泳后用染色液（質量分數0.25%考馬斯亮藍R-250、體積分數45.5%乙醇溶液和體積分數9%冰醋酸溶液）染色1 h。然后，用體積分數45.5%乙醇溶液和體積分數9%冰醋酸溶液脫色至背景清晰。最后，用凝膠成像儀進行拍照分析。

1.3.8 MP二級結構測定

MP的二級結構利用圓二色光譜儀測定，參考Zou Ye等[7]方法并適當修改。用磷酸鹽緩沖液將MP稀釋至0.1 mg/mL，放入1 mm的比色皿中，以磷酸鹽緩沖液為對照。掃描范圍為260～190 nm，步階為1 nm，對MP溶液進行掃描。掃描結束后用CDNN軟件計算蛋白質的二級結構相對含量，MP平均殘基摩爾質量取110 g/mol[32]。

1.3.9 AFM觀察

利用NanoManVS AFM進行表觀形貌觀察。參考李雨楓等[33]的方法并適當修改。用磷酸鹽緩沖液將MP樣品質量濃度稀釋至1 mg/mL，取適量的稀釋后的MP滴到云母片上，自然晾干后進行AFM分析。所有高度圖像使用Nanoscope分析軟件進行“平滑”處理。

1.4 數理處理與分析

本實驗重復3 次，結果表示為平均值±標準差。采用Origin 8.5軟件作圖。用SPSS v.21.0軟件進行統計分析，使用單因素方差分析法對數據進行分析，采用Duncan’s方法作多重比較，P＜0.05時認為不同處理組間存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 MP的TSI分析結果

圖1 低頻高強度超聲波處理MP對其乳液TSI的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on the TSI of MP-stabilized emulsions

TSI是由Turbiscan LabExpert計算得出的統計因子，其表示在給定的時間內體系中所有失穩過程的總和，主要通過匯總乳析、絮凝和/或聚結等變化情況來反映乳化液的動態不穩定性[34]。TSI和穩定性成反比，即TSI越高，樣品越不穩定。MP經過不同超聲波時間處理后形成乳液的TSI如圖1所示。對照組TSI在1 800 s內從0增加到1.24，而經過超聲波處理（3 min和6 min）的MP制備乳液TSI分別增加到0.49和0.28，明顯低于對照組，表明超聲處理可以增加MP乳液的穩定性。超聲波處理6 min的TSI最低，這說明超聲波處理MP 6 min制備的乳液最穩定。這表明超聲波處理能夠改善MP的乳化穩定性。這也是因為利用超聲“空化效應”產生的機械力作用于MP溶液，使制備乳液油滴分布更加均一[17]，乳液不容易發生相分離和絮凝。

2.2 MP的界面張力分析結果

圖2 低頻高強度超聲波處理MP后對其與大豆油界面張力的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the interfacial tension of MP-stabilized emulsions

如圖2所示，所有MP樣品的界面張力隨著時間延長而下降，表明MP具有較好的乳化活性，能夠吸附油滴，使油-水界面趨于穩定。但是，與對照組相比，經過超聲波處理的MP與大豆油之間的界面張力明顯降低。尤其是超聲波處理MP 6 min組與大豆油之間的界面張力達到最低。O’Sullivan等[3]發現類似結果，超聲波處理植物蛋白可以顯著降低蛋白溶液與植物油的界面張力。Xiong Wenfei等[35]研究發現高強度超聲波處理能夠降低卵清蛋白與大豆油之間的界面張力。不同處理組之間界面張力變化的差異，可能與使用的分散相性質和乳化劑類型有關[36]。為降低界面張力，乳化劑必須能夠迅速吸附在油-水界面，并進行構象重排，使油滴分散在水相[37]。通過物理或化學手段使MP變性并且鏈展開，MP表面的活性位點數量增加，使埋藏在蛋白質內部的疏水基團暴露，增加MP的疏水性，因而MP分子能夠以更快的速率吸附到油-水界面上，油-水界面接近飽和的單分子層最大吸附量也越多，形成一層致密的富有彈性的界面蛋白膜，從而降低油-水界面張力，提高MP的乳化穩定性[37]。圖2結果表明，超聲波處理可以有效增強MP的移動性，促進MP在油-水界面形成界面層，使界面張力迅速降低。

2.3 MP的溶解度、濁度和ζ電位分析結果

表1 不同超聲波處理時間對MP ζ電位、溶解度和濁度的影響Table 1 Effect of ultrasonic treatment time on the ζ-potential,solubility and turbidity of MP

蛋白質溶解度為在特定的提取條件下，溶解到溶液中的蛋白質量占總蛋白質量的比例，它反映的是蛋白質與水之間的平衡與相互作用。不同超聲波處理時間對MP溶解度的影響如表1所示。隨著超聲波處理時間的不斷延長（0～6 min），MP的溶解度顯著增加（P＜0.05），由52.22%增加到74.17%。這與Hasnain等[11]的結果相似，超聲處理的肌動球蛋白的溶解度隨著時間的延長而增加。MP溶解度的增加可能是由于MP溶液暴露在高強度超聲波中，超聲波產生的“空化效應”以及湍流可能使MP展開，更多的親水基團暴露到蛋白質的表面，不溶性的蛋白質聚集體破碎，形成更多的可溶性蛋白質聚集物[38]。超聲處理MP，提高其溶解度，對乳液的穩定性起重要作用。MP作為乳化劑，具有更好的可溶性，有助于在水相使可溶聚集體分散，形成穩定包埋油滴的保護膜[39]。另外，需要注意的是對照組使用常規高鹽溶液溶解，MP的溶解度已達到較高水平。但是在本課題組前期研究中發現未超聲處理MP的乳液極易發生分層，這說明超聲波處理MP改善其乳化特性，不僅是由于MP的溶解性增強，還需要進一步探究超聲處理對MP結構的影響。

表1顯示不同時間超聲處理MP的濁度變化。濁度用于評估超聲處理MP分散體的聚集水平[31]；濁度越高，說明蛋白質聚集程度越高。當超聲時間從0 min延長至6 min時，A350nm和A660nm均顯著降低（P＜0.05），表明高強度超聲波破壞氫鍵和疏水相互作用，導致大的蛋白質聚集體破碎成小的蛋白質聚集體，這些結果與MP溶解度增加相對應。

ζ電位表示懸浮粒子的近表面電荷量，是蛋白質膠體/乳劑穩定的一個重要參數[6]。較低的ζ電位絕對值導致靜電斥力降低，并趨于絮凝或聚集[7]。如表1所示，超聲波處理對MP的ζ電位有顯著的影響（P＜0.05）。隨著超聲時間延長到6 min，MP帶有更多的負電荷，具有較高的ζ電位絕對值。ζ電位絕對值的增加可能是由于蛋白質的展開和蛋白質三級結構的變化引起的蛋白質表面暴露了更多的帶負電荷的氨基酸基團[40]。該結果表明，超聲處理增加MP的帶電荷量，使蛋白在油滴之間的靜電相互作用和空間排斥作用增強，有助于穩定油滴。

2.4 MP的黏度分析結果

圖3 不同超聲波處理時間對MP黏度的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the viscosity of MP

如圖3所示，在剪切速率范圍內，隨著剪切速率的增加，所有樣品的黏度先迅速下降后緩慢下降，表現為假塑性流體。Chen Xing等[41]也報道了MP具有假塑性。與對照組相比，處理組的黏度發生明顯降低，表明隨著超聲處理時間的延長，黏度逐漸下降，MP的流動性增加。謝亞如等[42]的研究表明高強度超聲波處理會降低肌球蛋白的低溫自組裝程度，使樣品的零剪切黏度降低。這是由于超聲波處理能夠破壞MP結構的完整性，導致MP的粒徑減小[6]，流動性增加，表現出比較低的黏度。因此，超聲波處理后MP黏度降低，增強其流動性，促進MP吸附油滴。

2.5 MP的SDS-PAGE分析結果

如圖4所示，比較未處理的MP，超聲波處理沒有引起蛋白質電泳圖譜的主要蛋白分子條帶變化，這表明超聲波處理沒有改變蛋白分布。此外，在SDS-PAGE中沒有觀察到聚合，這說明超聲波處理后沒有形成新的團聚體。電泳結果與Wang Jingyu等[14]的研究報道類似。

圖4 不同超聲時間處理的MP的SDS-PAGE圖譜Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the SDS-PAGE profile of MP

2.6 MP二級結構分析結果

圖5 不同超聲波時間對MP的CD光譜的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on the CD spectrum of MP

表2 不同超聲波處理時間對MP二級結構相對含量的影響Table 2 Effect of ultrasonic treatment time on the secondary structure contents of MP

如圖5所示，不同超聲波時間處理的MP的CD光譜在208 nm和222 nm附近出現兩個負的吸收峰。這兩個峰是α-螺旋結構的吸收峰，而且α-螺旋含量與峰強度成正比[43]。隨著超聲波處理時間的延長，這兩個峰的強度開始衰減，說明MP的α-螺旋結構被破壞。利用CDNN軟件計算MP的α-螺旋相對含量，如表2所示，與未超聲波處理相比，超聲波處理6 min的MP中α-螺旋相對含量顯著降低（P＜0.05），由22.10%下降到17.70%。除此之外，β-折疊、β-轉角和無規卷曲相對含量顯著增加（P＜0.05），這可能是α-螺旋結構的破壞轉化為其他二級結構。因為α-螺旋結構是由氫鍵穩定的，上述結果說明超聲波處理可以破壞MP的氫鍵，使MP二級結構由有序結構轉變為無序結構，增加MP的延展性，促進乳化活性增強。

2.7 MP的AFM分析結果

AFM的微懸臂一端有一個納米級探針，當進行樣品掃描時，由于樣品表面的起伏，探針與樣品之間范德華力的不同會引起微懸臂發生彎曲，從而使照射在懸臂的激光束發生偏轉，這種信號被光電二極管收集，轉換為電信號，從而獲得樣品的表觀形貌。不同超聲波處理時間對MP表面形貌的影響如圖6所示。可以觀察出未經超聲波處理的樣品具有一束完整線性特征結構的蛋白分子，說明此時的蛋白質結構還保持著高度有序的狀態。李雨楓等[33]研究發現水洗提取的MP也具有這種高度有序的狀態。經過超聲波處理后的樣品，蛋白質的結構被破壞，表現為較小粒徑的分散顆粒。從三維結構（圖6a～c）可以看出蛋白質表面逐漸平坦，高度降低。

圖6 不同超聲波處理時間的MP的AFM圖Fig.6 AFM images of MP subjected to ultrasonic treatment for different durations

同時，從表3中Rpm結果也可以看出超聲處理后樣品的高度降低。高度降低可能是因為超聲處理破壞了蛋白質的α-螺旋結構（表2），使蛋白質變得疏松，高度下降。Huang Liurong等[44]研究了超聲輔助酸處理大豆分離蛋白，結果發現使其高度降低的原因可能是超聲處理破壞了大豆分離蛋白的亞基結構，當松散的亞基結構進一步解離，粒子的高度就會降低。為了進一步研究MP的表面形貌，利用Nanoscope分析軟件分析得出樣品的粗糙度，結果見表3。

表3 不同超聲波處理時間對MP表面粗糙度的影響Table 3 Effect of ultrasonic treatment time on the surface roughness of MP

表3為不同超聲波處理時間下樣品粗糙度的結果。與未經超聲處理的樣品相比，超聲波處理后樣品的粗糙度均降低，表明超聲波處理可以降低樣品的表面粗糙度，使樣品表面更光滑。MP表面粗糙度降低可能是因為超聲的機械作用使MP的結構被破壞，形成較小體積的單體蛋白或低聚體蛋白。Zou Ye等[45]在研究低頻超聲處理改善鵝胸肉的嫩度過程中，發現肌動球蛋白較大的聚合物碎片塌陷，形成較小的體積。Jin Jian等[46]研究發現超聲處理能夠降低谷蛋白的高度和表面粗糙度。這些結果表明超聲波處理破壞了MP的有序結構，降低了MP的粒度，使粒度更加均一，從而促進與油滴交互作用，降低油-水界面張力，增強乳化特性。

3 結 論

低頻高強度超聲波（20 kHz、450 W、0 W/cm2）處理MP，會改變蛋白質結構性質。與未經超聲處理的樣品相比，超聲處理可以增加蛋白聚集體的可溶性，增強流動性，提高靜電相互作用，降低蛋白聚集程度。隨著超聲波處理時間的延長（0～6 min），α-螺旋的相對含量顯著降低（P＜0.05），β-折疊、β-轉角和無規卷曲相對含量顯著增加（P＜0.05），MP有序結構遭到破壞，向無序結構轉變。同時，AFM結果顯示超聲波處理破壞了MP的結構，降低其粒度并提高了均一性，因而超聲波處理后MP的乳化穩定性指數增加，使蛋白在油-水界面張力迅速降低，有助于MP乳化特性的改善。因此，超聲波可以提高MP的乳化特性，這與超聲波引起MP結構的改變密切相關。