草魚魚鱗抗菌肽與肉桂精油聯合抑菌作用及機理

王雪燕，陳 瑛，張嘉敏，施永清*

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

抗菌肽的化學本質是多肽，具有非特異性抗細菌、真菌和病毒的作用[1]。不同于傳統抗生素的作用機制，抗菌肽不易誘導耐藥菌株的產生，且抗菌譜廣，對細菌、真菌、病毒、原生動物和癌細胞均有作用[2]。它還具有穩定性好、水溶性好、對高等動物正常細胞幾乎無傷害、在體內無殘留等特點[3]，是化學防腐劑、抗生素等防腐抗菌藥物很好的替代品[4-5]，抗菌肽乳酸鏈球菌素Nisin已成功作為天然食品防腐劑應用于食品防腐保鮮領域中[6-9]。關于魚類抗菌肽的相關報道很多，如Lin等[10]從石斑魚（Epinephelus coioides）中得到的抗菌肽Epinecidin-1分別對副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α均顯示抑菌作用；Lauth等[11]研究表明源自條紋鱸（Morone saxatilis）皮膚和鰓的抗菌肽Moronecidin對所有的G＋細菌和大多數G-細菌均有抑制作用。本項目團隊經過數年酶解魚鱗研究獲得魚鱗抗菌肽，其對G＋細菌和G-細菌都有不同程度的抑菌效果[12]。天然植物精油也具有廣譜抑菌活性，Friedman等[13]發現，肉桂醛、香芹酚、丁香酚和百里香酚這4 種物質具有較強的抑菌活性，對腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagicE.coli）O157:H7、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等多種病原菌都表現出較強的體外抑菌活性[14-15]。但是，添加精油會使食品感官品質受到較大影響。將精油和抗菌肽復配使用，可以降低精油使用過多造成的感官影響[16]。

目前，國內外關于抗菌肽、精油的抑菌機制已有較多報道。抗菌肽通過破壞細胞膜完整性導致細胞裂解，或者通過與膜的相互作用形成瞬態孔隙，將抗菌肽運輸到胞內并作用于胞內物質[17]。香辛料植物精油成分對微生物細胞抗菌作用機理為：降解細胞壁，破壞細胞質膜，破壞膜蛋白，使胞內成分滲出、胞質凝結，以及損耗分子主動運輸力[18]。

目前關于草魚魚鱗抗菌肽和肉桂精油復配抑菌研究尚鮮見報道。本研究以草魚魚鱗抗菌肽、肉桂精油為原料，采用棋盤稀釋法測定二者聯合抑菌效果。通過對受試菌生長曲線、細胞膜滲透性、胞外乳酸脫氫酶活性測定以及分析菌膜穿膜效率等探究復配抑菌劑的抑菌機理，以期為研制抑菌聯合制劑提供理論依據和數據參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella choleraesuis）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）、毛霉（Mucor wutungkiao）、根霉菌（Rhizopus）、酵母菌（Saccharomycetes）由浙江工商大學食品與生物工程學院微生物實驗室提供。

草魚魚鱗抗菌肽由浙江工商大學食品與生物工程學院食品加工與活性包裝實驗室提供；肉桂精油 江西省吉水縣益康天然香料油提煉廠。

NB培養基、NA培養基 杭州微生物試劑有限公司；碘化丙啶 上海麥克林生化科技有限公司；丙酮酸鈉 阿拉丁試劑（上海）有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 上海源葉生物科技有限公司；寬分子質量標準蛋白Marker 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Mini電泳儀、電泳槽、Gel Doc XR＋凝膠成像系統美國Bio-Rad公司；YXQ-LS-18SI自控型手提式滅菌器、SPX-250B-Z生化培養箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；TGL-16gR臺式高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；HYG-IIa回轉式恒溫調速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設備有限公司；DDSJ-308A電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；CytoFLEX流式細胞儀 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚魚鱗抗菌肽的制備及分子質量測定

參考顧晨濤[19]的方法并略作修改，采用酸性蛋白酶酶解魚鱗，經葡聚糖凝膠Sephadex G-15、Sephadex G-50凝膠過濾層析和纖維素DEAE-52陰離子交換層析分離純化制備草魚魚鱗抗菌肽，采用Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法[20]測定其分子質量。

1.3.2 最小抑菌濃度測定

采用微量肉湯試管稀釋法[21]測定魚鱗抗菌肽和肉桂精油對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、黑曲霉、產黃青霉、毛霉、根霉菌、酵母菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。取200 μL生長至對數期（1×106CFU/mL）的菌液依次加入稀釋后的試液中，分別得到質量濃度梯度256、128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL的魚鱗抗菌肽試液，32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μL/mL的精油試液，每組做3 組平行。以只加入受試菌液為陰性對照，只加入抗菌肽或精油為陽性對照。將細菌置于37 ℃培養24 h，真菌28 ℃培養48 h，以管中出現彌散渾濁、底部有圓形或絲網狀沉淀現象作為菌體生長觀察指標[22]，以無肉眼可見沉淀的試管所對應濃度為抗菌肽、肉桂精油的最小抑菌濃度。

1.3.3 聯合抑菌效果評價

根據上述最小抑菌濃度測定結果，采用棋盤稀釋法[23]進行聯合抑菌實驗。用含吐溫-80的無菌水稀釋經0.22 μm膜過濾滅菌的肉桂精油，分別得到劑量梯度為4 MIC、2 MIC、1 MIC的肉桂精油乳液（A）。用一定質量的草魚魚鱗抗菌肽配制質量濃度梯度為4 MIC、2 MIC、1 MIC的草魚魚鱗抗菌肽溶液（B）。取9 支含3 mL肉湯培養基的無菌試管，按照橫排3 管縱列3 管的順序排布，根據三因子二次正交法復配后，使得A、B的最終質量濃度分布如圖1所示。在各組試管中分別加入200 μL受試菌懸液，漩渦振蕩混勻，細菌置于37 ℃培養24 h，真菌28 ℃培養48 h，按1.3.2節法對各試管內菌株生長情況進行檢驗，實驗重復3 次，取平均值。

圖1 棋盤稀釋法示意圖Fig.1 Sketch map of checkerboard method

以分級抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，FIC）指數作為復配抑菌實驗結果評價的判定依據。計算公式如式（1）所示。

式中：MICA復配為A和B聯用時A對應的最小抑菌濃度；MICB復配為A和B聯用時B對應的最小抑菌濃度；MICA為A單獨使用時的最小抑菌濃度；MICB為B單獨使用時的最小抑菌濃度。

FIC指數判定標準為：FIC指數＜0.5時為協同作用；0.5＜FIC指數＜1時為相加作用；1＜FIC指數＜2時為無關作用，FIC指數＞2時為拮抗作用。

將實驗結果顯示協同作用的菌株繼續測定生長曲線、細胞膜滲透性、胞外乳酸脫氫酶活性變化，并且采用流式細胞儀分析穿膜效率。

1.3.4 復配抑菌劑對菌體生長曲線的繪制

采用分光光度法[24]分析抑菌劑對受試菌生長曲線的影響。將受試菌株培養至對數生長期（1×106CFU/mL），分別加入1/4 MIC復配抑菌劑，以吐溫-80水溶液作為空白對照。將對照組和實驗組放入搖床中進行同步培養，每隔2 h取出對應的試管，振蕩器上振蕩8 s，立即用紫外-可見分光光度計測定OD600nm，連續測定24 h，記錄實驗結果，平行3 次取平均值。以抑菌時間為橫坐標，OD600nm為縱坐標，繪制復配抑菌劑作用下受試菌的生長曲線。

1.3.5 電導率的測定

用磷酸鹽緩沖液清洗活化后的受試菌體并使之混勻，使復配抑菌劑在菌懸液中的終質量濃度為1 MIC。取5 mL菌懸液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，置于37 ℃（細菌）或28 ℃（真菌），120 r/min的搖床中，每隔2 h取樣1 次，離心，取上清液3 mL測定其電導率[25]。最后121 ℃滅菌20 min，冷卻后離心，測定上清液的電導率，以不加復配抑菌劑的吐溫-80水溶液作為空白對照。實驗重復3 次，取平均值。按式（2）計算相對電導率，以相對電導率反映細胞膜滲透性，相對電導率越高，細胞膜滲透性越強。

式中：K為某時刻電解質相對電導率/%；J0為搖床孵育前電導率/（mS/cm）；J1為某時刻電導率/（mS/cm）；J2為滅菌、冷卻至室溫后電導率/（mS/cm）。

1.3.6 胞外乳酸脫氫酶活力測定

參考陳惠等[26]方法并略作修改。在復配抑菌劑中加入培養至對數生長期的受試菌株至終質量濃度為1 MIC，以不加復配抑菌劑組為對照。置于37 ℃（細菌）、28 ℃（真菌），120 r/min的搖床中培養，每隔4 h取樣，離心（8 000 r/min，10 min），將35 mg煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）用10 mL 0.2 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液稀釋，得到NADH溶液（現配現用）。將5.0 mg丙酮酸鈉用58 mL 0.2 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液稀釋，得到丙酮酸鈉溶液（現配現用），并于25 ℃水浴中提前預熱。取適量0.2 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液于340 nm波長處調零后，將10 μL上述離心上清液加入至5.8 mL NADH及0.2 mL丙酮酸鈉溶液中，用紫外-分光光度計于340 nm波長處測定吸光度，重復3 次，取平均值，以吸光度為縱坐標、時間為橫坐標作標準曲線以計算每分鐘吸光度的變化值；通過考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白質的質量濃度，再按照公式（3）計算胞外乳酸脫氫酶的比活力。

式中：L為乳酸脫氫酶比活力/（U/mg）；ΔA340nm/min為每分鐘吸光度變化值；B為稀釋倍數；V1為上清液體積/μL；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 流式細胞儀分析菌膜完整性及穿膜效率

將受試菌液培養至對數生長期，離心（8 000 r/min、10 min），用生理鹽水洗滌2～3 次，再重懸為1×106CFU/mL的菌懸液。加入經50 μg/mL碘化丙啶染液標記的復配抑菌劑溶液，至終質量濃度為1 MIC，漩渦振蕩混勻[27]。細菌置于37 ℃、真菌于28 ℃避光孵育2 h，同時以等體積生理鹽水作陰性對照。結束后，離心（8 000 r/min、15 min），用生理鹽水洗滌2～3 次以洗去多余的熒光染料，離心洗滌后用生理鹽水重懸，用流式細胞儀檢測菌體穿膜效率[28]。實驗做3 組平行，取平均值。

1.4 數據分析

實驗結果采用Excel 2010軟件進行處理，并用Origin 8.0軟件對實驗數據進行作圖。

2 結果與分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE結果

將經酸性蛋白酶酶解、Sephadex G-15、Sephadex G-50和DEAE-52層析柱分離純化后得到的草魚魚鱗抗菌肽進行Tricine-SDS-PAGE分析，結果見圖2。

圖2 草魚魚鱗抗菌肽Tricine-SDS-PAGE圖譜Fig.2 TSDS-PAGE electrophoregram of antimicrobial peptide from grass carp scale

由圖2可知，分離純化后的草魚魚鱗抗菌肽只顯示出單一條帶，說明草魚魚鱗抗菌肽已達到電泳純。利用凝膠成像系統軟件分析得出其分子質量約為14.3 kDa。

2.2 聯合抑菌效果分析

以金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、黑曲霉、產黃青霉、毛霉、根霉菌、酵母菌為受試菌，測定草魚魚鱗抗菌肽與肉桂精油聯合抑菌效果，結果如表1所示。草魚魚鱗抗菌肽對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的MIC為16 μg/mL，對副溶血性弧菌、大腸桿菌、產黃青霉的MIC為32 μg/mL，對黑曲霉、毛霉、根霉菌、酵母菌的MIC為64 μg/mL，表現出廣譜抑菌活性。其中，對金黃色葡萄球菌類革蘭氏陽性菌及沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的抑菌效果相較于Li Chunlei等[29]所研究的AI-Hemocidin 2抗菌肽對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的抑菌效果（MIC為37.5～300.0 μg/mL）好；且抑菌效果明顯優于王潔等[30]所研究的Cn-AMP2抗菌肽對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的抑菌效果（MIC為50～100 μg/mL）。

表1 抗菌肽和肉桂精油聯合抑菌MIC及聯合效果評價Table 1 Minimal inhibitory concentration and antimicrobial effects of antimicrobial peptide combined with cinnamon essential oil

肉桂精油對受試細菌的MIC范圍為2～4 μL/mL，對真菌的MIC為4 μL/mL。相較于王一非等[31]研究所得留蘭香微乳體系對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌的MIC為8～32 μL/mL，肉桂精油表現出了較強的抑菌活性。

草魚魚鱗抗菌肽與肉桂精油聯用時對金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、產黃青霉的FIC指數分別為0.375、0.5、0.5，表現為協同作用；對沙門氏菌、大腸桿菌、黑曲霉、毛霉、根霉菌、酵母菌的FIC指數大于0.5，表現為相加作用；對所有受試菌均無拮抗作用。復配抑菌劑中魚鱗抗菌肽MIC范圍為4～32 μg/mL，肉桂精油為0.5～2.0 μL/mL，均優于單獨使用的效果。

2.3 復配抑菌劑對菌體生長曲線的影響

圖3 肉桂精油復配劑對受試菌生長曲線的影響Fig.3 Effect of antimicrobial combination on growth curve of tested strains

由圖3可以看出，復配劑對受試菌的生長曲線產生了不同程度的影響。在0～2 h內，空白組與加樣組菌體的生長速率相差不明顯，2～16 h加樣組生長速率明顯較慢，16～24 h內兩組的菌體生長速率都有所減慢，且樣品組減慢的速率更快，該現象與盧曉等[32]研究發現0.2 mg/mL沒食子酸對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響相似。可能是復配抑菌劑的存在一定程度上影響了受試菌的生長周期，導致菌體對數生長期縮短、衰亡期加快以及生長速率緩慢，從而達到抑菌作用。

2.4 復配抑菌劑對細胞膜滲透性分析結果

圖4 肉桂精油復配劑對受試菌細胞膜滲透性的影響Fig.4 Effect of antimicrobial combination on cell membrane permeability of tested strains

由圖4可以看出，加入復配抑菌劑的菌體細胞相對電導率明顯高于對照組，在處理2 h后相對電導率變化明顯加快，8 h后變化相對減緩。這說明在抑菌劑的作用下，細胞膜的滲透性發生改變，使胞內鉀離子、鈉離子等電解質的不斷外漏，相對電導率持續增加。而經過長時間的處理后，由于大量離子的丟失導致菌體胞內穩定環境被破壞，相對電導率變化減緩。本實驗中4～8 μg/mL魚鱗抗菌肽與肉桂精油復配對各受試菌相對電導率為50%～75%，與劉俊義等[33]所研究的0.45～0.50 mg/mL文冠果種仁甾醇相比效果更明顯（對受試菌相對電導率為25%～35%）。

2.5 復配抑菌劑對胞外乳酸脫氫酶活力分析結果

圖5 肉桂精油復配劑對受試菌乳酸脫氫酶比活力的影響Fig.5 Effect of antimicrobial combination on lactic dehydrogenase specific activity of tested strains

由圖5可知，加樣組的胞外乳酸脫氫酶比活力均明顯高于對照組，在4～12 h內胞外乳酸脫氫酶比活力增加明顯，12 h后相對減緩。可能是抑菌劑作用于受試菌體細胞膜上的某些靶點，使得細胞膜受到一定程度的損傷后原先存在于細胞質中的乳酸脫氫酶外泄至膜外。隨著作用時間的延長，由于胞內的乳酸脫氫酶不斷地溢出，嚴重影響了細胞正常的糖酵解及呼吸代謝過程，從而達到了抑菌作用。

2.6 復配抑菌劑對菌膜穿膜效率分析結果

圖6 流式細胞儀分析復配抑菌劑處理對金黃色葡萄球菌細胞的影響Fig.6 Flow cytometry analysis of the effect of antimicrobial combination on Staphylococcus aureus cells

圖7 流式細胞儀分析復配抑菌劑處理對產黃青霉細胞的影響Fig.7 Flow cytometry analysis of the effect of antimicrobial combination on Penicillium chrysogenum cells

圖8 流式細胞儀分析復配抑菌劑處理對副溶血性弧菌細胞的影響Fig.8 Flow cytometry analysis of the effect of antimicrobial combination on Vibrio parahaemolyticus cells

由圖6～8可知，經復配抑菌劑處理的金黃色葡萄球菌穿膜效率達到了72.76%，與單獨使用肉桂精油（57.61%）、魚鱗抗菌肽（38.16%）相比有明顯差異。產黃青霉穿膜效率達到了61.56%，與單獨肉桂精油（51.04%）、魚鱗抗菌肽（30.08%）相比有明顯差異。副溶血性弧菌穿膜效率達到了51.04%，與單獨使用肉桂精油（49.45%）、魚鱗抗菌肽（37.05%）相比，有一定提升效果。與盧佳等[34]所研究的少棘蜈蚣抗菌肽Scolopin 2-NH2（穿膜效率41.28%、43.05%）相比抑菌效果明顯。

可見，草魚魚鱗抗菌肽與肉桂精油復配劑對于產黃青霉、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌抑制效果明顯，且比單獨使用時增效明顯。

3 結 論

本研究結果表明分子質量約為14.3 kDa的草魚魚鱗抗菌肽與肉桂精油聯用對金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、產黃青霉表現為協同作用；對沙門氏菌、大腸桿菌、黑曲霉、毛霉、根霉菌、酵母菌表現為相加作用，對所有受試菌均無拮抗作用。復配抑菌劑的抑菌機理可能是通過影響菌體的生長周期，致使菌體出現對數生長期的縮短以及衰亡期的加快；通過改變細胞膜通透性，使得胞內電解質物質、乳酸脫氫酶不斷地溢出到胞外，細胞生長受到抑制進而導致死亡。但其具體的抑菌機制尚有待于進一步研究，希望本實驗能為進一步研究抗菌肽與精油復配劑的抑菌機制和開發高效安全、綠色環保的抑菌劑提供理論依據。