新型冠狀病毒感染實驗動物的風險評估?

李永超 李韻峰 關雅倫 黃忠強 劉書華 李雪嬌 李 舸 張 鈺

(廣東省實驗動物監測所,廣州 510663)

新型冠狀病毒全球大流行嚴重危害人類的生命,由于病毒在人群的廣泛傳播導致人類密切接觸的實驗動物和常見家畜存在感染風險。本文根據新型冠狀病毒與ACE2結合位點,通過比對結合位點在不同物種間的變化,預測不同實驗動物對新型冠狀病毒的易感性,有助于篩選新型冠狀病毒感染動物模型,并提醒我們注意疫情期間的實驗動物飼養。

1 新型冠狀病毒概述

2019年12月暴發的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)可以引起人群聚集性感染,并迅速蔓延[1-2]。SARS-CoV-2可以通過飛沫和接觸在人與人之間傳播,感染后出現發熱、乏力、干咳、呼吸困難,部分嚴重病例可呈現急性呼吸窘迫綜合征或膿毒癥休克,甚至死亡[1,3]。目前該病毒尚無特效治療藥物和疫苗。

冠狀病毒在系統分類上屬冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)。冠狀病毒屬的病毒是具外套膜(envelope)的正鏈單股RNA病毒,直徑約80～120 nm,病毒有包膜,包膜上存在棘突,整個病毒像日冕,不同冠狀病毒的棘突有明顯的差異。在冠狀病毒感染細胞內有時可以見到管狀的包涵體,冠狀病毒核酸序列還是RNA病毒中最大的。當前發現冠狀病毒的宿主包括人、蝙蝠、駱駝、小鼠、豬、貓、犬、禽類等動物,幾乎常見的家畜和模式動物都是冠狀病毒的宿主(圖1)。已有報道感染人的冠狀病毒共 6種,即 HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1 和 MERSCoV,而MERS-CoV-2是第7種能夠引起人感染的冠狀病毒。

第九次國際病毒學分類委員會報告將冠狀病毒科分為三個屬,即 α、β和 γ屬。其中,β屬冠狀病毒包括β冠狀病毒1、人冠狀病毒 HKU1、鼠冠狀病毒、家蝠冠狀病毒HKU5、果蝠冠狀病毒HKU9、嚴重急性呼吸綜合征(SARS)相關病毒等7個種。β冠狀病毒1包括人冠狀病毒(HCoV-OC43)、豬血凝性腦脊髓炎病毒 (porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHEV)等;鼠冠狀病毒包括鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)、大鼠冠狀病毒(rat coronavirus);嚴重急性呼吸綜合征(SARS)相關病毒包括SARS病毒和其它SARS樣冠狀病毒。根據全基因組比較分析,SARS-CoV-2與蝙蝠的RaTG13相似性高達96%,與SARS-CoV相似性約為82%。SARS-CoV-2與RaTG13、SARS-CoV存在于一個進化簇中[4-5],這說明 SARS-CoV-2與 RaTG13、SARS-CoV具有同源性。

圖1 冠狀病毒進化樹注:標尺表示每個核酸位點的替換值,分支長度按每個位點核酸替換的比例繪制,分支上的數字表示在引導重復中該分支的百分比(引自GISAID)Fig.1 Phylogenetic analysis of coronavirus familyNote:The scale bars represent 1000 substitutions per nucleotide position,Branch lengths are drawn to a scale of nucleotide substitutions per site and Numbers above individual branches indicate percentage bootstrap replicates(from GISAID)

2 新型冠狀病毒感染機制分析

冠狀病毒首先通過棘突蛋白(spike)吸附在宿主細胞表面,然后進入宿主細胞、啟動復制增殖。冠狀病毒spike蛋白包括S1與S2兩個亞基,S1亞基分為S1-NTD(N terminal domain)和S1-CTD(C-terminal domain)兩個結構域,它們都可以作為受體結合結構域(receptor-binding domain,RBD)。冠狀病毒RBD參與結合宿主受體,這些宿主受體包括血管緊張素Ⅰ轉化酶2(angiotensin I converting enzyme 2,ACE2)、二肽基肽酶 4(dipeptidyl peptidase 4,DPP4)、氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)和癌胚抗原相關細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen related cell adhesion Molecule 1,CEACAM 1)等[6]。其中β屬SARS-CoV的S1-CTD與ACE2蛋白結合[7],MERS-CoV S1-CTD與 DPP4蛋白結合[8],TGEV和PRCV S1-CTD與APN結合[9-10],MHV S1-CTD與小鼠 CEACAM 1受體結合[11]。同屬冠狀病毒S1-CTD高度相似,但識別的受體不同,然而不同的冠狀病毒S1-CTD也可以識別相同的受體[6]。

SARS-CoV和SARS-CoV-2與宿主細胞結合的受體均為ACE2[7,12],我們對人、模式動物和常見家畜等ACE2蛋白進行進化分析(圖2)發現,人與黑猩猩、非洲綠猴、恒河猴的 ACE2蛋白進化關系較近;人與小鼠的ACE2同源性約為82%,與倉鼠的同源性約為84%。通過蛋白結構預測和三維結構分析均發現,SARS-CoV-2在與ACE2受體結合感染人的過程中,其S蛋白的胞外域與ACE2的親和力比SARS-CoV高10～20倍[13],而且 SARS-CoV-2在人群的感染有隱蔽性,因此 SARS-CoV-2在人類及動物中的傳播能力可能遠遠高于SARS-CoV。

圖2 ACE2蛋白進化樹注:根據各物種ACE2蛋白的氨基酸序列,利用MEGA X軟件(Neighbor-joining法,bootstrap為1000)構建進化樹,標尺表示每個氨基酸位點的替換值0.02Fig.2 The phylogenetic relationships of ACE2 proteinNote:Phylogenetic analysis was performed using MEGA X software and Neighbor-joining methods with bootstrap value 1000.The scale bars represent 0.02 substitutions per amino acid

3 實驗動物對新型冠狀病毒的易感性評價

已有報道,SARS-CoV可以感染非洲綠猴、恒河猴、食蟹猴、豬、雞、貓、雪貂、小鼠和倉鼠等動物[14-20]。Lu等[21]通過比較 ACE2上與 SARS-CoV RBD結合的氨基酸殘基位點在不同物種間的變化(表1),分析SARS-CoV的跨物種傳播能力,結果顯示SARS-CoV可以感染的宿主包括人類、非洲綠猴、恒河猴、狨猴、倉鼠、貓、果子貍、浣熊、雪貂、小鼠和蝙蝠[21-22]。其中,非洲綠猴、恒河猴與人類的ACE2位點氨基酸完全一樣,易被SARS-CoV感染。而其他動物與人類ACE2的結合位點存在2～9個突變,與SARS-CoV RBD結合強弱不同,但這些動物仍然能夠被感染,突變位點越少的動物被病毒感染的風險越大。大鼠和小鼠在結合位點的突變高達9個,與SARS-CoV RBD結合能力較弱,病毒感染后癥狀相對較輕。只有在高表達人ACE2的轉基因小鼠中,SARS-CoV才能有效地感染小鼠并導致死亡,同時產生典型的肺、腦等組織病變特征[23-24]。

表1 ACE2與SARS-CoV的結合位點及其在不同物種間的變化Table 1 The variant of binding sites between ACE2 and SARS-CoV in different species

雖然SARS-CoV-2與SARS-CoV的結合受體均為ACE2,但二者基因組相似性只有約82%。ACE2與SARS-CoV-2 RBD的結合位點有13個,且這些位點大多與ACE2和SARS-CoV的結合位點不同[12]。通過對人、模式動物和常見家畜及其他動物 ACE2上與SARS-CoV-2 RBD結合的氨基酸殘基位點進行分析(表2)發現,ACE2上與SARS-CoV-2 RBD的結合位點在不同物種間更加保守。其中,恒河猴、倉鼠與人的位點完全一樣;牛、山羊、綿羊、狨猴、兔子分別有2個位點不一樣;豬、貓、駱駝、穿山甲分別有3個位點不一樣;而蝙蝠中,中華菊頭蝠有4個位點不同和皮氏菊頭蝠有5個位點不同。雪貂、小鼠和大鼠分別有5、5、6個位點不同。因此,位點比較結果表明SARS-CoV-2最易感的動物可能是猴和倉鼠。目前的研究也證實,猴仍然是構建 SARS-CoV-2感染模型最L想的模式動物。基于我們對ACE2的結合位點分析,倉鼠可能也對新型冠狀病毒易感,但該結果還需要進一步的病毒學實驗進行驗證。與SARS-CoV不易感染小鼠相同,野生型小鼠對SARSCoV-2同樣表現為不易感。Bao等[25]也證實,只有攜帶人hACE2的轉基因小鼠才能夠被SARS-CoV-2感染,且肺部表現毛玻璃癥狀。動物模型是新冠病毒研究的重要工具,開展動物受體結合位點比對分析,篩選對 SARS-CoV-2易感的動物,對提升動物模型研究,加快藥物和疫苗的研究具有重要意義。

表2 ACE2與SARS-CoV-2結合位點及其在不同物種間的變化Table 2 The variant of binding sites between ACE2 and SARS-CoV-2 in different species

綜上所述,猴、倉鼠等實驗動物被SARS-CoV-2感染的風險最高,其他實驗動物ACE2上的病毒結合位點與人差異不大,仍然不能排除被感染的可能。因此,在疫情期間要加強實驗動物的飼養管L,規范動物實驗和操作。對從業人員的健康狀況進行定期檢測,做好人員的職業安全防護,防止實驗動物從業人員的健康與安全。