安神補腦液對抑郁癥睡眠障礙大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸的影響?

王琦偉 許文杰 許春立 蔣瑞沖

(上海中醫藥大學附屬第七人民醫院卒中中心,上海 200137)

抑郁癥在我國的發病率持續升高,而抑郁癥的危害受認知的程度也日益提升[1]。睡眠障礙在抑郁癥中較為常見,90%的抑郁癥患者均存在睡眠問題[2]。大多數抑郁癥患者有睡眠障礙癥狀(失眠或嗜睡),這也屬于該疾病的診斷標準[3]。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸在應激障礙發病過程中起核心作用,是反應機體應激狀態(主要包括失眠、抑郁、焦慮等)的中樞神經系統,其過度活躍是構成精神疾病的基本生物學機制之一[4-5]。有研究發現,糖皮質激素升高導致HPA軸過度激活,會使抑郁癥患者發生認知障礙,出現情緒低落、失眠等癥狀[6]。安神補腦液是一種中藥復方制劑,具有養心安神、定志安神的功效,對于入睡困難或睡后易醒具有較好的功效[7-8],但其治療抑郁癥睡眠障礙的作用機制目前尚不明確。本研究探討安神補腦液對抑郁癥睡眠障礙大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸的調節作用,為安神補腦液治療抑郁癥引起的睡眠障礙的機制研究提供L論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:選擇清潔級SD雄性大鼠40只,8～12周,體質量 220～250 g,購自中國科學院昆明動物研究所,實驗動物生產許可證號:SCXK(滇)K2016-0001。

1.1.2 實驗藥物:安神補腦液(以下簡稱補腦液)購自吉林敖東延邊藥業股份有限公司,原藥為35倍濃縮液,蒸餾水配制成不同濃度的藥液,現配現用(每天配制一次)。

1.1.3 實驗主要試劑:TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司),β-EP、AQP4、GAPDH 普通 PCR 上下游引物[生工生物工程(上海)股份有限公司],SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa),Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific),固定液(4%甲醛溶液)(北京博奧龍免疫技術有限公司),重鉻酸鉀濃硫酸(北京嘉美紐諾生物科技有限公司),多聚左旋賴氨酸(上海恒遠生物技術發展有限公司),PBS緩沖液(上海索萊寶生物科技有限公司),DAB顯色液(武漢博士德生物技術開發有限公司),蘇木素、中性樹膠(南京建成科技有限公司),二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司),石蠟(上海歌凡生物科技有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(Thermo公司),兔抗大鼠 β-EP單克隆抗體、兔抗大鼠 AQP4單克隆抗體、HRP標記山羊抗兔IgG(購自北京博奧森生物技術有限公司);其余試劑均為國產分析純。

1.1.4 主要儀器:實時熒光定量 PCR儀(Bio-Rad公司),Z216MK型冷凍離心機(德國 HERMLE公司),酶標儀(Thermo公司),脫水機、包埋機(武漢俊杰電子有限公司),石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司),烤箱(天津市萊玻瑞儀器設備有限公司),正置光學顯微鏡、成像系統(日本尼康),載玻片(Servicebio)。

1.2 建立動物模型、分組及藥物治療

將大鼠按隨機數字表法分成4組:正常對照組,造模組(抑郁癥睡眠障礙模型組,安神補腦液低劑量組,安神補腦液高劑量組),每組10只。正常對照組大鼠正常飼養,不進行任何刺激;抑郁癥睡眠障礙大鼠模型的建立,根據參考文獻[9],造模組大鼠接受不可預見溫和應激(CUMS),結合孤養(單獨分籠飼養),處L 18 d后用小平臺睡眠剝奪技術行快速動眼相(REM)睡眠剝奪72 h。

1.2.1 CUMS法:參考文獻[9],共9種刺激。(1)禁水17 h;(2)禁食、禁水20 h;(3)持續光照17 h;(4)傾斜鼠籠(45°)17 h;(5)4℃冰水游泳5 min;(6)潮濕墊料21 h;(7)搖晃(1次/s,15 m in);(8)夾尾1 m in;(9)行為限制2 h。每天隨機采取1種,共刺激18 d。

1.2.2 小平臺睡眠剝奪技術:造模組大鼠于造模的第19天開始,連續72 h快速動眼相(REM)睡眠剝奪。剝奪箱為30 cm×30 cm×36 cm的玻璃水箱,內置直徑為6 cm、高 18 cm的平臺,箱注水高度距平臺面約1 cm。實驗期間室內溫度控制在18.0～22.0℃,水溫保持在 20.0℃左右。造模共進行21 d。

1.2.3 藥物干預:將造模組隨機分為模型組、安神補腦液低劑量組、安神補腦液高劑量組。按人與大鼠等效計量換算法,補腦液低劑量組(灌胃人用藥原液2 m L/kg,相當于成人每日用量);補腦液高劑量組(灌胃人用藥原液6 m L/kg,相當于成人每日用量的3倍);正常對照組和模型組灌胃等量的蒸餾水,每天1次,持續給藥2周。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠行為學評價:分別于造模后、藥物干預后7 d、14 d對各組大鼠進行敝箱實驗(OFT)[10]。敝箱裝置由木板制成,高40 cm,長、寬均為 80 cm,底面和四周為黑色,并將底面劃分為25個面積相等的正方形格子(5 cm×5 cm)。將大鼠放置于中心方格內,觀察其5 m in內穿越格子數,四爪均進入方格數為水平運動得分;記錄大鼠的直立次數為垂直活動得分。

1.3.2 下丘腦相對質量:稱量大鼠體質量后進行腹腔注射1%戊巴比妥鈉(4 m L/kg)麻醉,迅速取出下丘腦,用預冷的生L鹽水沖洗殘余血液,濾紙吸干,稱其質量(mg)。計算下丘腦相對質量(mg/g)=下丘腦凈質量/大鼠末次體質量。稱量結束后立即置于-80℃冰箱保存備用。

1.3.3 HPA軸相關神經遞質水平的測定:稱重后麻醉,腹主動脈取血,3 000 r/min,4℃離心15 m in分離血清,采用ELISA法檢測血清中促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質醇(CORT)的含量。

1.3.4 免疫組化法檢測β-內啡肽(β-EP)和水通道蛋白4(AQP4):麻醉處死大鼠,取腦組織并分離海馬組織,用4%多聚甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片(厚度 4μm),3%雙氧水浸泡 10 min,滴加50μL山羊血清封閉液封閉30 m in。棄去山羊血清,加50μL兔抗大鼠β-EP單克隆抗體、兔抗大鼠AQP4單克隆抗體孵育,室溫孵育30 m in,棄去一抗后滴加二抗孵育30 m in。滴加DAB顯色劑,鏡下觀察組織顏色后進行蘇木素復染。乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。將制作好的大鼠海馬組織切片置于顯微鏡下觀察海馬 CA2區 β-EP及AQP4蛋白陽性表達;并采用圖像分析軟件測定β-EP及AQP4平均光密度(A)。

1.3.5 RT-PCR法:檢測腦組織中 β-EP、AQP4的mRNA表達水平:Trizol法提取大鼠腦組織中總RNA,逆轉錄得到 cDNA,以 GAPDH為內參,采用RT-qPCR檢測腦組織中β-EP、AQP4 mRNA表達水平。引物由華大基因股份有限公司設計合成,引物設 計 如 下:β-EP上 游5′-CTTTCCGCGACAG AGCCTC-3′,下游 5′-CAGGTTGCTTTCCGTGGTG3′;

AQP4 上 游 5′-GGGTTGGACCAATCATAGGC GGT-3′, 下 游 5′-GCAGGAAATCTGAGGCCAGTTCTAGG-3′;

GAPDH 上 游 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGA ATG-3′,下游 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

反應條件:95℃預變性5 m in;95℃變性10 s,59℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個循環。每個樣本重復檢測3次,β-EP、AQP4基因相對表達量按公式(2-△△Ct法)計算。

1.4 統計方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析,所有實驗數據均呈正態分布,結果用平均數±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析對多樣本實驗結果進行統計分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠死亡情況

實驗過程中共有4只大鼠死亡,其中模型組死亡2只,補腦液低劑量組和補腦液高劑量組各死亡1只。

2.2 安神補腦液對大鼠行為學表現的影響

與正常對照組相比,模型組大鼠在造模后,水平活動與垂直活動得分均顯著降低(P<0.05);安神補腦液治療后第7天,補腦液高劑量組大鼠水平活動與垂直活動得分較模型組均顯著升高(P<0.05),補腦液低劑量組大鼠水平活動與垂直活動得分較模型組雖有升高,但差異無統計學意義(P>0.05);治療14 d后,兩治療組大鼠水平活動與垂直活動與模型組比較均有明顯改善(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時期行為學表現Table 1 Behavior of rats in different periods

2.3 各組大鼠下丘腦相對質量的比較

與正常對照組相比,模型組大鼠體質量顯著降低,下丘腦相對質量顯著升高,均具有統計學意義(P<0.05);補腦液低劑量組大鼠體質量較模型組雖有上升,但差異無統計學意義(P>0.05);補腦液高劑量組大鼠體質量與模型組相比顯著升高,但與正常對照組相比顯著降低(P<0.05),下丘腦相對質量與模型組相比顯著降低(P<0.05),與正常對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠下丘腦相對質量Table 2 Relative weight of hypothalamus

2.4 安神補腦液對HPA軸相關神經遞質的影響

與正常對照組相比,模型組、補腦液低劑量組和補腦液高劑量組大鼠血清 CRH、ACTH、CORT表達水平均顯著升高(均P<0.05);補腦液低劑量組和補腦液高劑量組CRH、ACTH、CORT表達水平與模型組相比顯著降低(P<0.05);補腦液高劑量組ACTH、CORT表達水平較補腦液低劑量組顯著降低(P<0.05),而CRH表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠HPA軸相關神經遞質的表達水平Table 3 Expression levels of HPA axis related neurotransmitters in each group

2.5 各組大鼠腦組織中β-EP和AQP4的蛋白表達水平

免疫組化結果顯示,β-EP主要表達于細胞核中,表現為細胞核中出現棕黃色顆粒;AQP4主要表達于細胞核和細胞漿中,表現為細胞核和細胞漿中出現棕黃色顆粒。模型組大鼠腦組織 β-EP和AQP4蛋白表達水平較正常對照組相比均顯著降低(P<0.05);補腦液低劑量組和補腦液高劑量組β-EP和AQP4蛋白表達水平與模型組相比明顯上升,且補腦液高劑量組β-EP和AQP4蛋白表達水平高于補腦液低劑量組(P<0.05)。見表4,圖1。

表4 各組大鼠β-EP和AQP4平均光密度值Table 4 Mean optical density of β-EP and AQP4 in each group

圖1 各組大鼠腦組織中β-EP和AQP4蛋白表達水平(免疫組化,×200)Fig.1 Expression levels of β-EP and AQP4 protein in brain tissue of rats in each group (immunohistochemistry,×200)

2.6 各組大鼠腦組織中β-EP和AQP4 m RNA表達水平

與正常對照組相比,模型組大鼠腦組織 β-EP和AQP4 mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05);補腦液低劑量組和補腦液高劑量組 β-EP和 AQP4 mRNA表達水平與模型組相比明顯上升(P<0.05);兩治療組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織中β-EP和AQP4m RNA表達水平注:與正常對照組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05Fig.2 Expression levels of β-EP and AQP4 m RNA in brain tissue of rats in each groupNote:Compared with the normal control group,?P<0.05;Compared with the model group,#P<0.05

3 討論

抑郁癥是一種嚴重致殘、危及生命的精神疾病,世衛組織預測,到2020年它將成為第二大主要疾病[11]。睡眠障礙是影響全世界數百萬抑郁癥患者的一種常見癥狀[12]。研究報道,在抑郁發作期的患者僅有7.2%沒有睡眠問題,由此可見,抑郁癥患者中睡眠障礙的發生率高,失眠是主要的表現形式[1]。動物對陌生的環境恐懼而導致其局限在中心活動,但動物的習性又促使它有往周邊活動的欲望和動機,而大鼠水平運動和垂直運動是測試動物在新的環境下的自主探究行為及緊張度的一種方法[13]。本研究模型組大鼠接受不可預見溫和應激(CUMS),結合孤養(單獨分籠飼養),處L 18 d后用小平臺睡眠剝奪技術行快速動眼相(REM)睡眠剝奪72 h,建立抑郁癥睡眠障礙模型。結果發現,與正常對照組大鼠相比,模型組大鼠水平活動與垂直活動得分均顯著降低,表明模型大鼠出現恐懼心L并且與臨床抑郁癥表現相似的癥狀。

抑郁癥睡眠障礙的病因機制一直是神經科學領域的研究熱點,目前普遍認為心L社會因素和各種生物學因素等致病因素的改變導致該病的發生[14]。下丘腦被認為直接對睡眠進行調控,而且下丘腦還參與形成抑郁癥的腦內神經回路。在應激反應初期,通過增加相應的應激器官,促進HPA軸的興奮性增高,使血液中的糖皮質激素升高,從而保護機體。HPA軸功能的完成是由下丘腦分泌CRH,刺激垂體分泌ACTH,最后刺激腎上腺分泌糖皮質激素(GC)[15-16]。近年研究表明,HPA軸可與神經系統和免疫系統相互作用共同影響抑郁癥的發生分展,其功能亢進不僅是抑郁癥重要的生L變化之一,而且還是可能的重要發病機制之一[17-18]。本研究結果發現,模型組大鼠體質量減輕,下丘腦相對質量顯著升高,且血清中CRH、ACTH、CORT表達水平均顯著升高,提示模型組大鼠HPA軸持續功能亢進,導致大鼠睡眠障礙,并可能通過影響食欲引起大鼠體質量下降。表明HPA軸的功能亢進可能是抑郁癥睡眠障礙的發生發展重要的生L變化之一。β-EP是一種活力較強的神經肽,具有止痛、抗抑郁、緩解壓力等作用,主要存在與下丘腦弓狀核和垂體中,起到抑制HPA軸功能紊亂的作用。當機體持續受到外界刺激后,HPA軸表現為功能亢進,導致β-EP分泌和釋放也受到影響[19]。有研究發現[20],圍絕經期抑郁癥模型大鼠血清中β-EP含量顯著降低。水通道蛋白4(AQP4)在腦組織中含量最為豐富,主要分布于下丘腦中,主要參與血漿滲透壓的調節和垂體加壓素的分泌。王宇紅等[21]研究報道,糖尿病并發抑郁癥大鼠AQP4表達減少,中樞神經系統內環境穩態被破壞。本研究結果發現,模型組大鼠腦組織β-EP、AQP4的表達水平較正常對照組均顯著降低,提示抑郁癥睡眠障礙引起的HPA軸功能紊亂可能是通過抑制β-EP和AQP4的分泌實現。

HPA軸和抑郁癥有重要的調控關系,因此尋找一種安全有效的抗抑郁癥藥物可有效改善患者睡眠質量,對治療抑郁癥患者的睡眠障礙具有重要意義。安神補腦液主要組成成分有甘草、鹿茸、淫羊藿、大棗、干姜等,全方諸藥相合,具有氣血雙補、安神益智之功,能促進腦部血液循環,改善睡眠和食欲,緩解機體疲勞,改善患者精神狀態[7]。張海晶等[22]對大鼠長期連續灌胃安神補腦液(2.5、5、10 m L/kg)觀察其對大鼠產生的毒性反應、嚴重程度、可能的毒作用靶器官及損害的可逆程度,結果發現安神補腦液長期用藥對大鼠未見明確的毒性反應,停藥后也無延遲性毒性反應。本研究采用安神補腦液治療抑郁癥睡眠障礙大鼠,結果發現治療后,大鼠水平活動與垂直活動得分較模型組均顯著升高;下丘腦相對質量及血清中 CRH、ACTH、CORT表達水平均顯著降低,而腦組織β-EP、AQP4的表達水平升高,提示安神補腦液可通過提高 β-EP、AQP4的表達水平,抑制HPA軸功能的紊亂。

綜上所述,安神補腦液可明顯抑制血清中CRH、ACTH、CORT的表達水平并提高腦組織β-EP、AQP4的含量,對抑郁癥睡眠障礙模型大鼠HPA軸具有較好的調節作用,為臨床治療抑郁癥睡眠障礙患者提供基礎實驗依據。然而安神補腦液中何種中藥成分起主要作用以及服用多少劑量安神補腦液的治療效果最好仍有待進一步研究發現。