制作簡易實驗動物霧化箱建立小鼠哮喘模型研究?

田 丹 許虎峰

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院科研實驗中心 北京市臨床醫學研究所 移植耐受與器官保護北京市重點實驗室 王松靈院士口腔與全身健康免疫研究實驗室 北京 100050)

哮喘在全世界的發病率正在逐步上升,目前已經成為全球人類健康的巨大威脅[1]。霧化吸入給藥是臨床治療呼吸道相關疾病的重要治療手段,也是實驗室進行呼吸道相關疾病研究的重要實驗方法[2]。目前越來越多的醫療廠商開發出小巧高效的藥物霧化吸入儀器用于各種呼吸道患者的居家給藥。相對家用型霧化器,用于動物研究的特制霧化箱可選型號少、價格偏高且便攜性偏低。因此,應用簡單易操作的方法將家用型醫療霧化吸入裝置改造為實驗動物霧化箱將為呼吸道疾病的順利研究提供便利。

本研究將利用家用霧化器和動物實驗室常見的獨立通氣鼠籠改造為實驗動物用霧化箱,并進行小鼠過敏性哮喘造模。結合家用霧化器易得與價格低廉的特點和實驗室已有條件以低成本制成動物呼吸道相關實驗的穩定模型。

1 實驗動物霧化箱制作與使用

1.1 制作材料

空氣壓縮式霧化器(魚躍醫療,型號403M)、橡皮筋、獨立通氣鼠籠(弘騰生物科技,型號9085D-64)

1.2 制作方法

清空鼠籠,取下鼠糧槽和鼠籠蓋,由外向內推進鼠籠蓋通氣閥并摘下固定橡膠圈,拆卸下鼠籠通氣口的彈簧和單向通氣閥(僅拆卸其中一個通氣閥即可)。摘下家用霧化器霧化杯上的面罩,將橡皮筋纏繞并套在霧化杯出口,保持適度松緊。將霧化杯旋轉插入鼠籠通氣閥的接口中,保持穩定。將霧化杯通過軟管連接上霧化器(圖1、圖2)。

1.3 使用方法

霧化杯中加入不超過8 m L需要霧化的液體,將霧化杯蓋緊杯蓋。開啟電源霧化后即可見白霧從通氣口噴入霧化箱,持續霧化半分鐘后霧化氣體即可充滿整個小鼠鼠籠。每個霧化箱同時可給1～20只小鼠進行霧化處L,8 m L霧化液體可持續霧化至少30 min。

2 利用自制霧化箱進行小鼠過敏性哮喘造模

2.1 實驗材料

圖1 制作簡易實驗動物霧化箱所需要的的材料注:A.制作簡易實驗動物霧化箱的主要材料;B.制作霧化箱需要的家用霧化器配套的霧化杯(出霧口直徑2.3 cm);C.制作霧化箱需要的小鼠籠蓋(通氣口內徑2.7 cm);① 家用霧化器主機;② 家用霧化器配套的霧化杯;③ 橡皮筋;④ 獨立通氣鼠籠;⑤ 通氣口上拆卸下來的通氣閥;⑥ 通氣閥上的固定橡膠圈;⑦安裝上通氣閥的鼠籠通氣口;⑧ 卸下通氣閥的鼠籠通氣口;⑨獨立通氣鼠籠蓋上的空氣過濾Fig.1 The materials used to manufacture the experimental animal atomization boxNote:A The materials used to manufacture the experimental animal atomization box;B atomization cup(outlet diameter:2.3 cm);C atomization box cover (outlet diameter:2.7 cm);①household medical atomizer;②atomization cup of household medical atomizer;③rubber band;④individually ventilated cage;⑤vent valve of mouse cage;⑥rubber ring of vent valve;⑦cage outlet blocked with vent valve;⑧cage outlet unblocked with vent valve;⑨air filtration window on cage cover

圖2 組裝完畢的霧化箱注:圖中藍色箭頭表示開啟霧化后的霧化氣流方向Fig.2 Assembled atomization boxNote:The blue arrow shows the direction of automization plow

6～8周齡雄性 C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2016-001。在首都醫科大學附屬北京友誼醫院動物實驗中心SPF級動物房飼養。所有動物實驗均經首都醫科大學附屬北京友誼醫院動物倫L委員會批準(批號:12-2001)。其他相關試劑:雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA,Sigma公司,貨號A2512,純度≥98%,用于腹腔注射;貨號 A5378,純度≥90%,用于霧化吸入),ImjectTMAlum鋁佐劑(Thermo公司,貨號77161),磷酸緩沖液(Corning公司,貨號21-031-CVR)。

2.2 哮喘造模方法

取6～8周齡雄性C57BL/6小鼠,在第0天和第14天進行腹腔注射20μg OVA蛋白免疫原(體積100μL,含 50μL ImjectTMAlum鋁佐劑和50μL磷酸緩沖液),對照組小鼠僅注射100μL磷酸緩沖液。從第28天開始,連續3 d應用自制霧化箱對兩組小鼠進行霧化1%OVA吸入,每次吸入30 m in。 在第32天,處死小鼠,取小鼠肺組織,進行石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅染色[3]。

2.3 造模效果檢測

將小鼠肺組織進行4%甲醛固定、石蠟包埋固定和切片,之后對切片進行蘇木精-伊紅染色。光學顯微鏡下觀察小鼠肺組織的炎癥細胞浸潤程度。如圖3所示,與僅進行1%OVA吸入的小鼠相比,進行2次OVA免疫和3次1%OVA吸入后,小鼠肺臟支氣管壁明顯增厚,肺組織產生大量炎癥細胞浸潤,表明成功建立了OVA誘導的小鼠過敏性哮喘模型。

圖3 利用自制霧化箱建立小鼠過敏性哮喘模型注:A.小鼠過敏性哮喘造模過程流程圖;B.僅接收霧化吸入 OVA的小鼠肺臟;C.進行腹腔注射OVA蛋白和霧化Fig.3 Build the mouse allergic asthma model with self-designed atomization boxNote:A.Schematic representation of the mouse allergic asthma procedure;B.The mouse was only inhaled with OVA;C.The allergic asthma mouse was vaccinated with OVA intraperitoneally and inhaled with OV

3 討論

本自制實驗動物霧化箱主要成本來自家用霧化器,市場售價不到300元,成本低廉,購買方便。該霧化器產生的霧化顆粒大小為3.9μm,5μm以下顆粒占比大于65%,能將霧化藥物充分運送至肺部支氣管[4]。霧化氣流量可達 10 L/min,最大霧化率≥0.2 m L/m in完全滿足了動物實驗的霧化需求。

除了主要部件霧化器外,本模型中還應用到了動物實驗室中廣泛使用的獨立通氣鼠籠。該型號鼠籠的通氣口內徑略大于霧化杯外徑,因此便于研究人員通過簡單的橡皮筋連接霧化杯和鼠籠并成功改造成為霧化箱。該型號鼠籠由于結構簡單易得和拆卸方便,大量應用于動物實驗室,并且在霧化吸入實驗完成后可以重新組裝為動物飼養籠具。本制作方法也利用了該鼠籠拆卸簡便的特點,將兩個通氣口中的一個拆卸下來,改造為霧化杯的通氣出口。如果需要加速霧化箱內的氣體流通,可以將另一通氣口也拆下,外接導管至水中。這種改造方法將使霧化箱中的空氣流動更加充分。本制作方法充分利用了獨立通氣鼠籠良好的過濾通氣特點,導入鼠籠內的藥物經鼠籠上方的過濾窗過濾后排到籠外,不會污染霧化箱外空氣。保證實驗環境的清潔和實驗人員的安全。

本霧化箱設計簡單小巧,便于維護、搬運,在動物實驗室中轉運操作時只需要帶入霧化器和橡皮筋等材料,方便消毒操作。同時本霧化箱具有繼續改裝潛力,除了打開另一通氣口作為通氣出口,霧化器還可依據相同的通氣口大小匹配更大的籠具,為大鼠等更大體積實驗動物的霧化吸入實驗提供可能。

本研究利用家用霧化器和動物實驗室獨立通氣鼠籠制作了簡易實驗動物霧化箱。我們利用該實驗動物霧化箱成功建立OVA蛋白誘導的小鼠過敏性哮喘模型并觀察到明顯的肺組織炎癥表現。該方法為簡便和低成本地進行實驗動物霧化實驗提供具有操作性的指導。