非洲綠猴和食蟹猴主要腸道細菌的實時定量PCR檢測及分析?

周小軍 尚艷姣 王 進 王 爽 邱業峰

(軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心,北京 100071)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染會導致獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),具有極高的病死率[1],AIDS的發病機制尚未完全闡明。猴免疫缺陷病毒(sim ian immunodeficiency virus,SIV)與HIV密切同源,SIV天然宿主包括烏白眉猴、非洲綠猴、山魈[2-3]等,研究天然宿主對SIV感染的適應性機制,有助于 AIDS致病機制研究、降低HIV的母嬰傳播、指導HIV疫苗開發,以及改善對 HIV感染者的長期治療。

腸道菌群與人體健康密切相關,腸道菌群參與人類的許多生L過程,如宿主代謝、自身免疫和過敏、大腦發育與神經交互等[4-6],此外腸道菌群組成差異還與HIV感染的預防和干預以及抗PD1腫瘤治療等有效性相關[7-8]。最近一項研究顯示,非洲綠猴在SIV感染早期會快速激活并維持其粘膜組織中的再生性傷口愈合機制,提示腸道屏障完整性可能在其對SIV感染適應性中發揮重要作用[9]。本研究擬對非洲綠猴和食蟹猴腸道細菌的相對含量進行比較研究,以明確非洲綠猴腸道菌群特征及其在SIV感染適應過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本中心飼養健康成年非洲綠猴和食蟹猴各12只,排除肥胖個體,普通級,5～8歲[SCXK(軍)2012-0019]。每日飼喂全價營養顆粒料,輔以清潔水果,自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本采集:每只動物收集其新鮮糞便樣本,按每份 200 mg等分后進行液氮速凍,轉運至-80℃冰箱保存。

1.2.2 糞便樣本 DNA提取:采用 QIAamp PowerFecal DNA Kit進行糞便樣本 DNA提取,-80℃冰箱保存。

1.2.3 糞便樣本DNA實時定量PCR分析:采用實時定量PCR體系(20μL)包括 10μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix,300 nmol/L正反向引物,300 ng糞便樣本DNA,其余用ddH2O補足。實時定量PCR反應條件為:95℃、3 min,95℃、30 s,退火40 s,72℃、30 s,40個循環,72℃、5 min,熒光信號采集設定為80℃、10 s以排除引物二聚體等干擾。針對16 s rDNA區域設計實時定量PCR引物,引物序列和退火溫度見表1。

表1 實時定量PCR引物序列和退火溫度Table 1 The list of primers and annealing temperatures used in the real-time PCR

圖1 非洲綠猴(AGM)和食蟹猴(CM)主要腸道細菌相對含量比較注:橫坐標表示動物分組,AGM和CM分別為非洲綠猴組和食蟹猴組;縱坐標表示細菌相對含量Fig.1 Comparsion of the relative abundance of main gut bacteria in AGM and CMNote:The abscissa represents groups while AGM stands for African green money group and CM stands for cynomolgus macaque group;the ordinate represents the relative abundance of main gut bacteria

1.2.4 統計方法:相對定量分析采用 ΔΔCt法,組間相對豐度倍數之間差異性分析采用t檢驗,P<0.05為顯著性差異,統計和作圖軟件采用GraphPad Prism 5。

2 結果

2.1 非洲綠猴和食蟹猴主要腸道細菌相對含量比較

與食蟹猴相比,非洲綠猴雙歧桿菌相對含量顯著偏低(比值0.7,P<0.05),乳酸菌相對含量顯著偏低(比值0.6,P<0.05),腸桿菌相對含量顯著偏低(比值0.5,P<0.05),擬桿菌-普氏菌相對含量顯著偏高(比值2.4,P<0.05)。

2.2 非洲綠猴和食蟹猴主要產丁酸鹽細菌相對含量比較

與食蟹猴相比,非洲綠猴主要產丁酸鹽腸道細菌普拉梭菌相對含量顯著偏高(比值3.4,P<0.05),真細菌相對含量顯著偏高(比值1.3,P<0.05)。腸道細菌產生短鏈脂肪酸、涉及代謝通路及產生菌信息見表2。

圖2 非洲綠猴(AGM)和食蟹猴(CM)主要產丁酸鹽腸道細菌相對含量比較注:橫坐標表示動物分組,AGM和CM分別為非洲綠猴組和食蟹猴組;縱坐標表示產丁酸鹽細菌相對含量Fig.2 Comparison of the relative abundance of butyrate-producing bacteria in AGM and CMNote:the abscissa represents groups while AGM stands for African green money group and CM stands for cynomolgus macaque group;the ordinate represents the relative abundance of butyrate-producing gut bacteria

表2 短鏈脂肪酸種類、涉及通路及產生菌信息Table 2 List of short-chain fatty acids,related pathways and producing bacteria

3 討論

SIV是與HIV-1和HIV-2相對應的靈長類動物免疫缺陷病毒的總稱,大量研究表明,SIV在過去幾十年中多次跨越種屬屏障傳播給人,在人群中進化、分化為具有不同流行和致病特征的各種HIV毒株[10]。SIV利用 CD4分子作為受體,以及 CCR5,CXCR4或者CCR2之一作為共受體感染非人靈長類動物[11-13]。SIV感染導致獼猴等非天然宿主引發AIDS,卻不會在天然宿主中造成進展性疾病。SIV天然宿主具有許多共性免疫學特征,其中T細胞上CD4表達的下調在包括非洲綠猴在內的一些SIV天然宿主中表現為進化上的保守性[14]。一項新近研究比較了恒河猴和非洲綠猴在SIV急性感染期腸道組織表達譜差異,發現非洲綠猴在SIV感染早期會快速激活并維持其黏膜組織中的再生性傷口愈合機制,也提示腸道屏障完整性可能在其對SIV感染適應性中發揮重要作用[9]。

研究非人靈長類動物腸道菌群具有一定的轉化醫學價值,早期和慢性期HIV感染病人的腸道菌群組成發生明顯改變[15],獼猴等非人靈長類動物在SIV感染早期的腸道炎癥反應與腸道菌群變化與HIV急性感染病人相似[16],而SIV感染慢性期非人靈長類動物腸道菌群組成變化趨勢與HIV慢性期病人符合性相對較低[17]。

非人靈長類動物腸道菌群組成以及各菌門間的優勢趨勢與多數其他哺乳動物相似[18],不同非人靈長類動物的腸道菌群組成在科和屬水平上的相似度要比門水平低得多。研究表明,非人靈長類動物腸道菌群組成不僅具有宿主物種特異性,而且在很大程度上能反映宿主的系統發育關系[19-21]。盡管食性(肉食性、植食性、雜食性)影響非人靈長類腸道菌群組成,一項對18種野生非人靈長類動物腸道菌群的比較研究顯示,宿主飲食生態位對靈長類菌群組成和功能的影響微弱,宿主系統發育和生L影響更大[22]。非洲綠猴在自發性高血壓、脂質代謝以及對SIV感染的致病性方面等具有顯著不同于食蟹猴的生物學特性[23-24],提示非洲綠猴和食蟹猴在腸道菌群組成上可能具有特征性差異。

本研究結果顯示,與食蟹猴相比,非洲綠猴雙歧桿菌、乳酸菌以及腸桿菌相對含量顯著偏低(P<0.05),而普氏菌以及丁酸鹽產生菌——普拉梭菌和真細菌相對含量更高(P<0.05)。腸道菌群與代謝和腸道穩態密切相關,腸道菌群的代謝產物短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs),如乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽,影響腸道免疫細胞穩態[25],其中丁酸鹽通過對腸道表皮細胞和免疫細胞發揮抗炎效果,進而影響腸道穩態和健康[26]。產丁酸鹽的細菌包括靈巧糞球菌、直腸真桿菌、霍氏真桿菌、普拉梭菌、羅氏菌等[27]。研究顯示,在 SIV急性感染獼猴以及HIV慢性感染病人中,普氏菌相對含量顯著上升,而乳酸菌相對含量顯著下降[28-32],與本研究中非洲綠猴特征相似。另外,非洲綠猴產丁酸鹽的細菌相對含量更高,反映出其腸道免疫細胞穩態和黏膜完整性具有不同于食蟹猴的進化適應特征,這可能是非洲綠猴作為SIV天然宿主長期自然進化選擇的結果,也為深入研究非洲綠猴的腸道菌群與代謝的相互作用及其對SIV感染進化適應的相關機制奠定了基礎。