參附注射液對內毒素休克大鼠肺組織表達PPARγ和TNFα的干預作用?

褚春薇 艾 飛 陳向云 郭俊峰 楊 毅 劉 霞

(1.貴州中醫藥大學基礎醫學院,貴陽 550025)(2.貴州中醫藥大學第二臨床醫學院,貴陽 550025)

內毒素休克是臨床常見的感染性急危重癥,內毒素休克患者免疫系統被過度激活,釋放大量炎性介質,盡管運用抗生素和糖皮質激素治療取得一定療效,但其致死率仍居高不下,且抗生素耐藥問題也越來越嚴峻[1]。內毒素休克患者中,約50%伴隨著急性肺損傷(ALI),甚至發展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),這也是內毒素休克的關鍵致死性因素,因此治療內毒素休克過程中,緩解急性肺損傷也極為重要[2]。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ),屬Ⅱ型核受體超家族成員,可參與脂類代謝、糖代謝、細胞分化和凋亡等多種生L和病L反應的調節[3]。研究證實,LPS所致的ALI通常伴隨著PPARγ的表達減少,核轉錄因子 κB(NF-κB)信號通路活化及TNFα和白細胞介素1β(IL-1β)等炎癥介質過度釋放[4];激活PPARγ可抑制 NF-κB通路活化,進一步抑制其下游炎癥介質的釋放,故PPARγ也成為治療炎癥的一個重要靶標,如PPARγ激動劑(如羅格列酮)用于治療ALI具有良好療效[5-6]。

內毒素休克屬中醫外感病“厥脫”范疇,參附注射液具有扶陽固脫的功效,臨床上廣泛用于治療內毒素休克,且療效確切,但其抗炎癥機制還有待深入探究和補充[7-9]。參附注射液是否通過上調PPARγ的表達而發揮其抗炎作用,目前尚無確切報道。本實驗通過建立內毒素休克大鼠模型,觀察參附注射液對肺組織中PPARγ和TNFα的表達及血漿中炎癥介質 TNFα和 IL-1β的影響,補充和完善參附注射液治療內毒素休克ALI的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性 SD大鼠48只,體質量(200±20)g,購自廣州中醫藥大學實驗動物中心,實驗動物生產許可證號:SCXK(粵)2013-0020。實驗動物的飼養及實驗方案經廣州中醫藥大學實驗動物倫L委員會批準。

1.2 主要藥品與試劑

LPS,美國 Sigma公司,批號:20160920;參附注射液,雅安三九藥業有限公司,批號:51020664;地塞米松,武漢艾美捷科技,批號:100129-201704;肝素,海通藥業有限公司,批號:170212136;兔抗PPARγ、兔抗 TNFα,美國 CST 公司,批號:2435s、11948s;兔抗 GAPDH,美國 Abclone公司,批號:9100002004;羊抗 兔 IGg-HRP,美 國 Abcam 公 司,批 號:GR313248-1;BCA蛋白定量試劑盒,上海貝博生物試劑公司,批號:BB18121;大鼠 IL-1β、TNFα免疫酶聯試劑盒,華美生物工程公司,批號:P002831、P005670;逆轉錄試劑盒,美國 Thermo Fisher公司,批號:AK6501;qPCR擴增試劑盒,天根生物有限公司,批號:FP209-02;ECL化學發光試劑盒,美國Millipore公司,批號:1801501;Trizol、蛋白酶抑制劑PMSF,上海碧云天生物技術公司,批號:101006、410051;戊巴比妥鈉、多聚甲醛、甲醇和脫脂奶粉等購自深圳市建陽生物醫藥科技有限公司。

1.3 主要儀器設備

力康Neofuge1600R臺式高速冷凍離心機;英國Astell Ama240高壓滅菌鍋;美國 EnSpire國多功能酶標儀;DHP-9012恒溫培養箱;美國 PowerPac300電泳儀;美國BIO-RAD轉膜儀、美國BIO-RAD熒光定量PCR儀;Tanon 5200全自動化學發光圖像分析儀。

1.4 實驗動物分組及處理

48只大鼠隨機分為對照組(Con)、內毒素休克組(LPS)、參附注射液低劑量組(SFL,5 m L/kg)、參附注射液中劑量組(SFM,10 m L/kg)、參附注射液高劑量組(SFH,15 mL/kg)、地塞米松組(DXM,1 mg/kg),每組8只。腹腔注射35 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后,暴露右頸總動脈,插管連接生物技能系統(BL-420)以檢測血壓。待血壓穩定后,腹腔注射LPS 15 mg/kg,觀察大鼠動脈壓直至大鼠達到休克狀態(以血壓下降至基礎血壓的2/3為判斷大鼠休克的指標)[10],對照組給予等量的生L鹽水。動物休克后,立即對大鼠進行分組,腹腔注射藥物,LPS組給予與藥物組等體積的生L鹽水。24 h后,心臟取血后處死動物,并迅速取出肺組織,生L鹽水洗凈,左肺用于 Western blot及 PCR分析,4%多聚甲醛固定右肺,用于形態學觀察。血液靜置1 h后4℃離心,收集上清(即血漿)于-80℃保存備用。

1.5 組織切片制作及觀察

肺組織常規制備4μm厚的石蠟切片,經蘇木精-伊紅(HE)染色后鏡下觀察,每組隨機觀察3例大鼠,每張切片隨機選5個高倍視野,觀察肺泡充血、出血、肺泡間隔水腫及中性粒細胞浸潤情況。

1.6 qPCR法檢測肺組織PPARγm RNA水平

每只大鼠取肺組織20 mg,提取樣品總 RNA,根據逆轉錄試劑盒說明書進行操作獲取 cDNA。以cDNA為模板,按PCR擴增試劑盒操作,獲取擴增產物。引物由上海生工設計合成,具體序列見表 1。反應程序為95℃反應5 s,60℃反應30 s,95℃反應15 s,收集熒光信號,共40個循環。每個樣品重復檢測三次,采用 2-ΔΔCt相對定量法(目的基因 Ct值/內參基因Ct值)對 PPARγmRNA表達進行相對定量,并將獲得數據進行統計。

表1 PCR引物序列Table 1 Prim er sequence of PCR

1.7 W estern b lot法檢測肺組織 PPARγ和 TNFα蛋白水平

每只大鼠取50 mg肺組織,加液氮研磨成粉末狀,加含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30 m in,4℃離心,12 000 r/min 15 m in,取上清即為總蛋白。測定蛋白濃度后煮沸變性,按每條泳道30μg蛋白質量上樣,經 SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉后對照Maker剪切目的條帶,分別以兔抗 PPARγ(1∶1 000)、TNFα(1∶1 000)和兔抗 GAPDH(1∶5 000)4℃孵育過夜。次日用羊抗兔IgG室溫孵育1 h后,滴加 ECL化學發光液,于全自動化學發光圖像分析儀顯影。實驗重復三次,采用Image J軟件將測得的各組灰度值與對應的內參值比較得出蛋白相對表達量。

1.8 血漿中TNFα和L-1β含量測定

用ELISA法對大鼠血漿中所含 TNFα和 IL-1β水平進行測定,每例樣品設置三個平行復孔,測定方法嚴格按照試劑盒操作說明步驟進行。將所得A值減去0濃度對照孔后,以標準品的A值繪制標準曲線圖,獲得濃度計算公式,根據公式與樣品A值計算樣品濃度。

1.9 統計方法

用Graphpad Prism 5.0軟件包對所得結果進行統計,統計結果用均數±標準差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較用t檢驗,采用Graphpad Prism 5.0對統計結果作柱狀圖,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺損傷情況

鏡下觀察,正常組大鼠肺組織結構清晰,肺泡間隔薄,無明顯充血、出血和炎性細胞浸潤(圖 1A)。模型組大鼠肺組織(圖1B),可見肺泡隔明顯水腫、充血(箭頭),肺間質內見大量中性粒細胞浸潤(□)。與模型組比較,地塞米松組(圖1C)、參附注射液中劑量組(圖1E)及參附注射液高劑量組(圖1F)均能明顯改善水腫、充血及炎性細胞浸潤程度,參附注射液低劑量組(圖1D)對肺組織的改善不如中、高劑量組,提示參附注射液中、高劑量均可減輕LPS所致的肺組織損傷及肺部炎癥反應,三種劑量不完全呈劑量效應關系,以中劑量效果最優。

圖1 各組大鼠肺組織結構(HE)注:□表示炎性細胞,→表示充血Fig.1 Lung tissue structure of rats in different groups(HE)Note:□point inflammatory cells and (→)point congestion

2.2 各組大鼠肺組織中PPARγm RNA水平檢測

經qPCR對內毒素休克大鼠肺組織中PPARγ mRNA水平進行檢測,結果見表2,LPS的刺激使PPARγmRNA水平顯著降低(P<0.01),參附注射液呈劑量依賴性增加PPARγmRNA轉錄水平。

表2 各組大鼠肺組織中PPARγm RNA 水平檢測結果Table 2 Detection of PPARγm RNA in lung tissue of rats in different groups

2.3 各組大鼠肺組織 PPARγ和 TNFα表達量檢測

經Western blot方法對內毒素休克大鼠肺組織中PPARγ和 TNFα蛋白進行半定量檢測,結果見圖2和表3,與正常組比較,LPS抑制 PPARγ表達(P<0.01),同時促進TNFα表達(P<0.01)。與LPS組相比,參附注射液呈劑量依賴性上調PPARγ的表達,同時顯著抑制TNFα的表達(P<0.01)。

圖2 各組大鼠肺組織PPARγ和TNFα蛋白電泳圖Fig.2 Electrophoretic map of PPARγ and TNFα protein expression in lung tissue of rats in different groups

表3 各組大鼠肺組織PPARγ和TNFα蛋白表達檢測結果Table 3 Expression of PPARγ and TNFα in lung tissue of rats in different groups

2.4 各組大鼠血漿中TNFα和IL-1β水平檢測

經Elisa法檢測內毒素休克大鼠血漿中TNFα和IL-1β分泌水平,結果見表4,LPS的刺激使血漿中TNFα和IL-1β水平均顯著增加(P<0.01),地塞米松組與參附注射液各劑量組血漿 TNFα和 IL-1β水平較LPS組顯著降低(P<0.01)。

表4 各組大鼠血漿TNFα和IL-1β濃度Table 4 Plasm a concentrations of TNFα and IL-1β in rats

3 討論

流行病學調查顯示,約1/2內毒素休克患者伴有急性肺損傷,其病L特征是毛細血管通透性增加和肺組織過度炎癥,內毒素血癥患者由早期的急性肺損傷(ALI)進一步引起嚴重急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),這是導致內毒素休克高死亡率的主要原因之一[2]。目前認為,ALI/ARDS為多器官功能不全的肺部表現,其實質就是一種炎癥反應,多種炎癥介質和細胞因子如 TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、趨化因子、黏附分子和前列腺素等參與發病過程,控制炎癥介質的級聯放大效應也成為治療感染性休克的重要手段[11]。

PPAR是核激素受體家族成員,包括 PPARα、PPARβ和PPARγ三種亞型,其分布和功能不盡相同。其中,PPARγ廣泛表達于脂肪組織、結腸、成纖維細胞、乳腺細胞、T淋巴細胞和單核巨噬細胞,作為一個配體激活轉錄因子,PPARγ除參與機體脂肪代謝、細胞生長與分化外,還參與調節機體免疫和炎癥反應[12-13]。人類的 PPARγ具有抗感染特性,它們對炎癥介質具有負反饋調節作用,可抑制炎癥介質的產生[14]。研究發現,LPS的刺激可使肺組織中PPARγ表達降低,可能促進肺部炎癥反應和組織損傷,且PPARγ的激活有利于肺組織損傷的轉歸,可見PPARγ可作為治療肺損傷的重要靶標[15]。

參附注射液組方源自《傷寒論》四逆加人參湯,此方以紅參為君藥,可補陽固脫、益氣回陽,為健脾補肺、扶正補虛之要藥;附片益火補陽,溫通十二經之陽氣,助君相之火破寒結之痹,是為臣藥;兩藥合用,可救人于瀕危之中,回陽于陰厥之時,故常用于感染性、失血性休克等亡陽之癥[7-9]。前期已有不少關于參附注射液治療 ALI的實驗研究,大多以NF-κB信號通路為研究對象,認為參附注射液可通過抑制NF-κB信號通路蛋白,從而抑制其下游炎癥介質的產生[16-19]。參附注射液對 ALI的治療作用是否與其對 PPARγ的調控有關,目前未見相關報道。

本研究首先從組織學角度觀察了參附注射液對內毒素所致肺損傷的保護作用:參附注射液可減輕LPS所致的肺泡隔水腫、充血和炎性細胞浸潤,為參附注射液保護內毒素急性肺損傷提供了很直觀的組織學依據。其次本研究關注PPARγ在內毒素休克肺組織中的轉錄和表達及參附注射液對其的干預作用:LPS使得大鼠肺組織中PPARγ轉錄和表達均下調,而參附注射液呈劑量依賴性上調其轉錄和表達;隨著PPARγ的上調,肺組織中的TNFα和血漿中兩種促炎因子分泌均顯著下降;提示參附注射液對ALI的治療作用及其對炎癥介質的抑制作用至少部分依賴于上調PPARγ的表達。本研究對參附注射液治療ALI的分子機制進行探索,豐富了其抗炎機制的L論依據。