犬細小病毒免疫球蛋白的有效性評價?

姜 旭 趙 健 倪婷婷 劉彥超 黃 宇 陳憲平 石 晶

(長春西諾生物科技有限公司,長春 130012)

犬細小病毒病是由犬細小病毒(canine parvovirus,CPV)感染引起的一種急性傳染病,臨床表現(xiàn)上以劇烈嘔吐、腹瀉,嚴重至血腥腹瀉為特征[1]。犬科、鼬科與貓科等物種感染后的死亡率不低于50%[2]。患病犬是本病的主要傳染源,其排泄的糞便、唾液、嘔吐物中含有大量CPV顆粒[3]。主要通過犬與犬的直接接觸或由污染的飼料通過消化道感染,在各年齡段都有感染,在6周齡～6月齡之間更容易發(fā)病[4]。鄧小蕓等[5]對哈爾濱局部地區(qū)犬細小病毒病的流行狀況進行研究,結(jié)果顯示細小病毒感染不分品種,公犬和母犬均可發(fā)病,其中2月齡犬最易發(fā)。本病早期治愈率較高,中后期及混合感染都將極大降低治愈率。當前,CPV及其多種變異毒株在全球多個國家普遍流行,且宿主范圍不斷擴大[6]。

免疫球蛋白是抗感染免疫的主力,具有抗菌、抗病毒和抗外毒素等多種活性。特異性免疫球蛋白在寵物上并沒有被廣泛的應用。本公司研發(fā)團隊開發(fā)了犬細小病毒免疫球蛋白注射液,為評價其有效性,使用本公司建立的犬細小病毒人工感染模型進行評價。

1 材料與方法

1.1 毒株及實驗動物

攻擊毒株:CPV-SD15株。

實驗動物:比格犬,購自沈陽康平實驗動物研究所,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2014-0003。實驗前分別對候選的2～3月齡實驗犬采集血液,分離血清,進行血凝抑制實驗,篩選抗CPV抗體陰性(hemagglutination inhibition,HI≤1∶23)的犬只到本公司實驗動物房進行實驗。

1.2 CPV對實驗犬的攻毒

實驗前在動物房適應性飼養(yǎng)7 d,無異常情況,所有實驗犬的糞便經(jīng)CPV檢測試紙測定為陰性。每日飼喂2次,保證飲水充足。飼養(yǎng)人員與實驗員要嚴格更換消毒后的外衣、靴子和手套。將每只實驗犬以咽部灌喂的方式進行攻毒,病毒液血凝效價為1∶27,劑量為 5 m L/次,共 3次,每次間隔 4 h。犬中有一只判定為發(fā)病即隨機分組,根據(jù)治療方法不同,分為模型對照組、對癥治療組與球蛋白治療組,每組5只,開始評價實驗。

1.3 評分與檢測

觀察實驗犬的精神狀態(tài)、飲欲/食欲、排便情況、嘔吐情況,依據(jù)臨床癥狀的輕重程度分為0～4分進行評分[7-8],評分標準見表1;采集肛門拭子,用CPV膠體金抗原檢測試紙進行檢測,若試紙檢測為陽性,并具有犬細小病的臨床癥狀,則判為發(fā)病。

表1 實驗犬細小病毒病臨床癥狀評分標準Table 1 Scoring criteria for clinical symptoms of the canine parvovirus disease

1.4 治療

對癥治療組:每日依照癥狀進行止血、止吐、退熱的對癥治療。主要包括:①氯化鈉注射液30～80 m L、頭孢噻呋鈉 20 mg/kg;②5%葡萄糖注射液50～80 m L,注射用輔酶A100單位,ATP 20 mg、維生素C 200 mg 混合后,10 mL/kg;1次/d,連用7 d。

球蛋白治療組:除同對癥治療組相同的輔助治療外,加入犬細小免疫球蛋白注射液肌肉注射,1 m L/kg,1次/d。

1.5 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計,進行組間樣本均數(shù)比較。

2 結(jié)果

2.1 排毒情況

實驗期間內(nèi),每日采集肛拭子用CPV膠體金抗原檢測試紙判斷糞便排毒情況。經(jīng)檢測,攻毒后4 d,有2只實驗犬開始排毒,對實驗犬進行隨機分組,攻毒后5 d有7只實驗犬排毒,在攻毒后6 d全部排毒,其中,模型對照組與對癥治療組排毒持續(xù)3～5 d,球蛋白治療組排毒3～4 d。

2.2 臨床評分結(jié)果

實驗期間,每日觀察實驗犬的臨床癥狀,根據(jù)評分標準進行評分。三組實驗犬在攻毒后均出現(xiàn)一定的臨床癥狀,模型對照組臨床評分逐日增加,2個實驗組在治療2 d后臨床評分開始下降,模型對照組臨床評分最高,球蛋白治療組評分低于對癥治療組。與模型對照組相比,對癥治療組具有無明顯治療效果(P>0.05),球蛋白治療組具有明顯治療效果(P<0.05),結(jié)果見表2。以病程為橫坐標,以分數(shù)為縱坐標,繪制實驗犬每日平均評分的折線圖(圖 1)。

表2 實驗犬治療前后評分統(tǒng)計結(jié)果Table 2 Statistical results of scores before and after the treatment of the canines

圖1 實驗犬每日平均評分結(jié)果Fig.1 Daily average score of the canines

2.3 血常規(guī)檢測結(jié)果

實驗期間,每日對實驗犬進行全血血常規(guī)檢測(表3),白細胞(WBC)的正常值為(6.0～17.0)×109/L。實驗各組均出現(xiàn)不同程度的炎癥反應,模型對照組WBC攻毒后4 d先上升后下降,對癥治療組與球蛋白治療組的WBC在攻毒后4 d先上升后下降,但球蛋白治療組的WBC在攻毒后8 d有平穩(wěn)/回升的趨勢。與模型對照組相比,對癥治療組與球蛋白治療組無顯著治療效果(P>0.05),結(jié)果見表3。以病程為橫坐標,以 WBC為縱坐標,繪制實驗犬每日平均WBC的折線圖(圖2)。

表3 實驗犬治療前后WBC統(tǒng)計結(jié)果Table 3 Statistical results of WBC before and after the treatment of the canines

圖2 實驗犬每日平均W BC結(jié)果Fig.2 Daily average WBC results of the canines

2.4 生化檢測結(jié)果

實驗期間,每日對實驗犬進行生化檢測,其中,球蛋白(GLOB)的正常值為23～52 g/L。模型對照組與對癥治療組的GLOB在發(fā)病后逐日下降,球蛋白治療組的GLOB開始發(fā)病時下降,隨著每日注射,波動式回升。與模型對照組相比,對癥治療組具有顯著治療效果(P<0.05),球蛋白治療組具有極顯著的治療效果(P<0.01),結(jié)果見表4。以病程為橫坐標,以GLOB數(shù)目為縱坐標,繪制實驗犬每日平均GLOB數(shù)目的折線圖(圖3)。

2.5 病理解剖結(jié)果

在本實驗中,各組發(fā)病率均為100%;模型對照組的死亡率為80%,好轉(zhuǎn)率為20%;對癥治療組的死亡率為60%,好轉(zhuǎn)率為40%;球蛋白治療組的死亡率為20%,好轉(zhuǎn)率為80%。在實驗犬死亡后,對其進行解剖,結(jié)果見圖4,主要病變在小腸部位,模型對照組與對癥治療組空腸和回腸病變嚴重,可見明顯的充血、瘀血以及腫脹,腸腔內(nèi)有紅色水樣物,球蛋白治療組基本正常。

圖3 實驗犬每日平均GLOB結(jié)果Fig.3 Daily average GLOB results of the canines

表4 實驗犬治療前后GLOB統(tǒng)計結(jié)果Table 4 Statistical results of GLOB before and after the treatment of the canines

圖4 犬小腸解剖Fig.4 Anatomy of the canines′small intestine

3 討論

球蛋白具有一定的免疫功能,能夠阻斷病原體對機體的危害,使病原體失去致病作用[9]。在醫(yī)學上,特異性免疫球蛋白已經(jīng)被廣泛的使用,如乙型肝炎、狂犬病等[10],犬細小免疫球蛋白作為一種新型的犬細小病毒病治療藥有著很好的應用前景。如今,針對犬細小病毒病的治療藥物有干擾素、單克隆抗體等,但這些藥物在犬中后期治療中效果并不明顯,且單克隆抗體的制備工藝復雜、成本高等限制了其應用。周靈等[11]進行了犬細小病毒免疫球蛋白對犬細小病毒中和活性的研究,結(jié)果表明犬細小免疫球蛋白的中和效果明顯優(yōu)于單克隆抗體,其免疫球蛋白的血凝抑制效價為1×211,中和效價為1∶873。在本實驗中,治療后的犬血凝抑制效價達到1×212,說明本實驗中所使用的免疫球蛋白對犬細小病毒有很強的抑制作用。犬細小病毒免疫球蛋白可提高犬血液中抗體水平,中和病犬體內(nèi)的細小病毒,有效阻止細小病毒對機體的繼續(xù)感染和侵害,發(fā)揮治療犬細小病毒病的作用。同時,犬細小免疫球蛋白自身又具有機體免疫調(diào)L作用,能激活病犬體內(nèi)的免疫細胞吞噬侵入的病原,迅速增強病犬免疫力和抵抗力[12-13]。在犬細小免疫球蛋白的臨床實驗方面,李六金等[14]進行了抗犬細小病毒免疫球蛋白的臨床應用研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)應用犬細小免疫球蛋白進行治療可以大大地提高犬細小病毒病的治愈率。在本實驗中,實驗組與對照組及對癥治療組在治療效果上的對比也很好地反映了犬細小免疫球蛋白在犬細小病毒病治療方面的優(yōu)勢作用。

以人工感染的模型對照組為基礎評價犬細小免疫球蛋白的治療效果。根據(jù)實驗犬表現(xiàn)出臨床癥狀的差異進行評分,癥狀越嚴重,分值越高,模型對照組評分逐日增加,發(fā)病后,模型對照組評分最高,對癥治療組評分次之,球蛋白治療組明顯低于另外2組。犬在感染細小病毒時會伴隨白細胞數(shù)目的變化,通常會引起白細胞數(shù)目的下降,通過對患病犬進行血常規(guī)檢查,可以通過觀察白細胞的數(shù)目推測該犬的病程及治愈狀況[15],模型對照組WBC數(shù)目先降低然后升高最后大幅下降,對癥治療組與球蛋白治療組比模型對照組的WBC更穩(wěn)定,而球蛋白治療組比模型組更穩(wěn)定。球蛋白具有免疫作用,當外來的刺激物入侵機體時,免疫系統(tǒng)會調(diào)控球蛋白的增殖對其進行抵抗[16]。根據(jù)生化檢測結(jié)果,可以針對臨床癥狀調(diào)整用藥,有利于提高CPV的治療率。血凝抑制效價與中和抗體效價具有一定正相關關系[17],模型對照組在攻毒后產(chǎn)生的HI抗體逐漸升高,而球蛋白治療組在注射免疫球蛋白后HI效價較模型對照組以及對癥治療組更高且穩(wěn)定。通過解剖結(jié)果,模型對照組與對癥治療組實驗犬的小腸部位可見明顯的腸炎型犬細小病毒病的癥狀,球蛋白治療組實驗犬在治療后小腸未見明顯病變。綜上所述,犬細小免疫球白具有較好的治療效果,可大大提高治愈率,發(fā)揮治療的作用。

本實驗表明,通過犬細小病毒人工感染模型組與治療組的臨床評分、WBC、GLOB以及病L解剖結(jié)果進行分析,可以對比出犬細小免疫球蛋白能夠提高犬細小病毒病的好轉(zhuǎn)率,為評價該治療性藥物的有效性研究奠定基礎。