鎂鍶合金膜在犬下頜骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用觀察

孫溪饒

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧錦州 121000

牙周病是臨床上常見的一類口腔疾病，發(fā)病率高，并且危害大，對(duì)人們的生活質(zhì)量影響嚴(yán)重，是臨床上導(dǎo)致成人牙列缺損的最主要原因，而嚴(yán)重的牙周炎可以導(dǎo)致牙齒脫落以及頜骨骨質(zhì)的破壞和吸收[1]。GBR利用生物屏障膜技術(shù)，將骨缺損區(qū)域與其周圍的結(jié)締組織進(jìn)行隔離，在一個(gè)相對(duì)封閉的環(huán)境里促進(jìn)植骨材料成骨，最終完成骨缺損的修復(fù)，不僅能夠解決臨床上由于重度牙周炎或因外傷、感染、腫瘤等導(dǎo)致的頜骨缺損，同時(shí)也為種植體區(qū)域局部骨量不足、種植體周圍炎引起的骨吸收等問題提供了新的可供選擇的有效治療方法[2,3]。礦化膠原膜具有骨誘導(dǎo)活性以及良好生物相容性，主要成分納米羥基磷灰石與Ⅰ型膠原均是骨組織的主要成分，能夠促進(jìn)人類間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，有良好的生物相容性、生物可降解性、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，但在GBR技術(shù)中礦化膠原較差的力學(xué)性能容易造成骨再生空間維持困難[4～8]。鎂基金屬材料的密度和彈性模量與人體的骨組織接近，其抗壓性能甚至較硫酸鈣、陶瓷等材料更優(yōu)，有望成為新的引導(dǎo)骨再生屏障膜材料[9～11]。然而鎂在體內(nèi)的快速且不可控制的腐蝕/降解行為，會(huì)使其高的機(jī)械強(qiáng)度可能較快地喪失，而且在降解過程中產(chǎn)生的氫氣會(huì)在植入物周圍形成氫氣囊，引發(fā)急性和不利的炎癥反應(yīng)[12,13]。在過往研究中，鎂基金屬已被廣泛研究用于骨組織工程支架，但只有少數(shù)研究[14]集中在使用鎂基金屬作為GBR技術(shù)的屏障膜。本研究通過制備犬下頜骨缺損模型，并植入鎂鍶合金膜，觀察其修復(fù)效果，旨在評(píng)估鎂鍶合金膜修復(fù)骨缺損的可靠性。

1 材料與方法

1.1 鎂鍶合金膜、礦化膠原膜 鎂鍶合金膜(1.5wt.%鍶)，中國科學(xué)院金屬研究所提供，尺寸20 mm×20 mm×0.38 mm。礦化膠原膜，北京奧精醫(yī)藥科技有限公司研制生產(chǎn)，尺寸20 mm×20 mm×0.38 mm。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用雄性健康雜種犬6只，12月齡左右，體質(zhì)量12～15 kg，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批編號(hào)為201808283)。所有犬分籠圈養(yǎng)，自由飲水，定時(shí)定量喂食。

1.3 犬下頜骨缺損模型制備、分組及鎂鍶合金膜、礦化膠原膜的應(yīng)用 預(yù)先拔除6只犬的下頜第2、第3前臼齒。待拔牙創(chuàng)愈合后，于下頜缺牙區(qū)分別在頰側(cè)建立箱型骨缺損模型，共計(jì)12個(gè)骨缺損模型。實(shí)驗(yàn)犬術(shù)前12 h禁飲食，稱重并記錄，鹽酸塞拉嗪注射液(陸眠寧)以0.1～0.15 mL/kg計(jì)量肌注麻醉，麻醉后實(shí)驗(yàn)犬取側(cè)臥位固定于試驗(yàn)臺(tái)上，常規(guī)消毒，鋪設(shè)手術(shù)洞巾，阿替卡因腎上腺素注射液局部浸潤麻醉。缺牙區(qū)于頰側(cè)牙齦梯形切口，分離黏膜暴露骨面，于牙槽嵴頂下約2 mm處建立骨缺損，長度為15 mm，寬度為5 mm，深度為3 mm。12個(gè)骨缺損模型隨機(jī)分為A、B、C組各4個(gè)，A組植入鎂鍶合金膜，B組植入礦化膠原膜，C組不作任何處理。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素以預(yù)防感染，并給予適當(dāng)營養(yǎng)支持。

1.4 犬術(shù)后一般情況觀察及取材 嚴(yán)密觀測(cè)所有實(shí)驗(yàn)犬的術(shù)后狀態(tài)，包括活動(dòng)、飲食以及創(chuàng)口狀態(tài)等，尤其注意實(shí)驗(yàn)區(qū)域是否出現(xiàn)出血、滲出、腫脹、溢膿、開裂等情況。術(shù)后12周處死全部實(shí)驗(yàn)犬，取材，觀察各組離體實(shí)驗(yàn)區(qū)域標(biāo)本牙齦狀態(tài)及骨缺損愈合豐滿度等大體情況。

1.5 犬下頜骨塊超微結(jié)構(gòu)觀察及骨體積分?jǐn)?shù)計(jì)算 犬下頜骨實(shí)驗(yàn)區(qū)域取材，制備A、B、C組目標(biāo)骨塊(近遠(yuǎn)中向約20 mm、高度約10 mm)，X線顯微鏡設(shè)置掃描電壓80 kV，曝光時(shí)間1 s，樣本沿垂直軸旋轉(zhuǎn)360°采集1 600張投影，投影像素尺寸22.481 4 μm。使用濾波反投影算法重建投影數(shù)據(jù)，隨后使用Avizo Fire軟件進(jìn)行處理和可視化。在A、B、C組的實(shí)驗(yàn)區(qū)域選取一個(gè)1 mm×1 mm大小的感興趣區(qū)域(ROI)，在此ROI基礎(chǔ)上選取一個(gè)1 mm×1 mm×1 mm大小的立方體感興趣體積區(qū)域(VOI)，觀察A、B兩組目標(biāo)骨塊超微結(jié)構(gòu)，計(jì)算A、B、C三組VOI區(qū)域骨體積分?jǐn)?shù)，分析比較A、B、C三組成骨效果。

1.6 犬下頜骨塊切片的骨組織結(jié)構(gòu)觀察 將經(jīng)過上述XRM檢測(cè)的A、B、C組實(shí)驗(yàn)區(qū)標(biāo)本放置于多聚甲醛溶液(4%，4 ℃)中，固定48 h，再經(jīng)24 h流水沖洗后，乙醇梯度脫水、合成樹脂浸潤約8 h，包埋后使用EXAKT系統(tǒng)切磨制備硬組織學(xué)切片，甲苯胺藍(lán)染色后封片，置于光鏡下進(jìn)行硬組織學(xué)觀察，分析比較A、B、C三組新生骨組織結(jié)構(gòu)。

1.7 犬肝、腎、牙齦組織病理學(xué)觀察 取犬肝、腎及實(shí)驗(yàn)區(qū)域牙齦組織，10%中性甲醛溶液固定剪切后的較小組織塊，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理后浸蠟包埋，切片后行HE染色，封片，光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，分析A、B兩組材料植入后實(shí)驗(yàn)犬主要臟器及牙齦結(jié)構(gòu)有無異常。

2 結(jié)果

2.1 各組大體觀察結(jié)果 所有實(shí)驗(yàn)犬生存狀態(tài)良好，術(shù)后首日狀態(tài)低迷，之后恢復(fù)正常，進(jìn)食良好。各實(shí)驗(yàn)犬均為一期愈合，未見材料暴露及創(chuàng)口感染。術(shù)后12周，A組植骨區(qū)外形輪廓較飽滿，質(zhì)地堅(jiān)硬；B組植骨區(qū)外形豐滿度稍遜，質(zhì)地尚可；C組因未作任何處理，外形輪廓塌陷。

2.2 各組X線射線顯微鏡檢測(cè)結(jié)果 術(shù)后12周，A、B兩組實(shí)驗(yàn)區(qū)均無植骨材料及膜材料影像，實(shí)驗(yàn)區(qū)充滿新生骨小梁組織，新生骨斷面呈現(xiàn)立體的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，分析VOI區(qū)域可見排列緊密、有序的粗大骨小梁；C組對(duì)應(yīng)區(qū)域內(nèi)新生骨小梁排列相對(duì)疏松、細(xì)小。A、B、C組骨體積分?jǐn)?shù)分別為43.92±1.25、43.67±1.18、20.73±1.02，A、B組分別與C組比較，P均<0.05。

2.3 各組硬組織學(xué)觀察結(jié)果 A、B兩組植骨材料及膜材料均完全降解無殘留，新生編織骨充填于骨缺損區(qū)域，互相交錯(cuò)、有序排列，切片均呈現(xiàn)出多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。C組僅見少許新生骨組織，且局限于骨缺損邊緣附近。

2.4 各組肝、腎、牙齦組織病理學(xué)觀察結(jié)果 各組犬可見其肝臟細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)正常，未見炎癥反應(yīng)；結(jié)構(gòu)完整的肝小葉中心中央靜脈清晰可見，胞核大而清晰，位于肝細(xì)胞中央位置。各組犬腎臟細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)正常，未見炎癥反應(yīng)；腎小球正常且散在分布，邊緣完整且規(guī)則，不規(guī)則的近曲小管管腔較小，胞質(zhì)嗜酸性；規(guī)則的遠(yuǎn)曲小管尚規(guī)則，胞質(zhì)呈弱嗜酸性。各組犬牙齦均可見其細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)正常，未見炎癥反應(yīng)；可見角化或不全角化的復(fù)層鱗狀上皮，上皮釘突較多且細(xì)長，深入固有層內(nèi)。

3 討論

牙周炎是口腔臨床常見的一類疾病，重度牙周炎可引起為嚴(yán)重的牙骨質(zhì)以及牙槽骨破壞和吸收[15]。除此之外，外傷、腫瘤術(shù)后亦或是先天性因素等都可能導(dǎo)致頜骨的骨缺損。針對(duì)骨缺損的骨移植術(shù)同GBR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，效果優(yōu)于二者的單獨(dú)使用。GBR屏障膜有保護(hù)植骨材料，增加其穩(wěn)定性的作用，使得植骨材料在骨修復(fù)期間不易發(fā)生松動(dòng)或移位的情況，與此同時(shí)屏障膜還能在一定程度上減緩植骨材料的降解速率[16]。因此，GBR屏障膜在GBR技術(shù)中起著至關(guān)重要的作用。目前，GBR膜主要有不可吸收屏障膜如純鈦膜等，以及可吸收屏障膜如Bio-Gide雙層膠原膜等[17]，可吸收屏障膜因其具有可生物降解性，能避免患者進(jìn)行二次手術(shù)移除不可吸收屏障膜所需的多余費(fèi)用及額外承擔(dān)的痛苦。因此，可吸收屏障膜是目前GBR屏障膜研究的熱點(diǎn)[18]。但目前可吸收屏障膜力學(xué)性能較差且不易固定，在臨床應(yīng)用中易出現(xiàn)屏障膜移位和難以維持成骨空間等問題[19]。

本實(shí)驗(yàn)使用的礦化膠原膜由北京清華大學(xué)研發(fā)，已廣泛應(yīng)用于臨床，具有突出的生物學(xué)性能，與其他膜材料相比，礦化膠原膜和成骨細(xì)胞有著更高的接觸水平。但礦化膠原膜力學(xué)性能較差，植入后可能會(huì)塌陷而影響成骨效果[20]。金屬材料在醫(yī)用方面歷史悠久，相比一些傳統(tǒng)的無機(jī)非金屬醫(yī)用材料、高分子醫(yī)用材料，其綜合力學(xué)性能、加工成型能力更為優(yōu)異。其中鎂基金屬相比其他的生物醫(yī)用金屬材料，有著諸多優(yōu)勢(shì)，具有可生物降解性，良好的生物相容性和力學(xué)性能，并具有優(yōu)異的成骨活性[21]。有研究表明，作為人體骨骼組成成分的鎂，能夠促進(jìn)局部Ca2+沉積，適量Mg2+能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，鍶同鎂一樣，均為人體必需元素，并且在骨組織中存在著人體內(nèi)99%的鍶，鍶作為鎂的合金化元素可以增強(qiáng)鎂合金的力學(xué)性能，并改善其耐腐蝕性，鎂鍶合金能夠促進(jìn)骨缺損區(qū)新生骨組織愈合和礦化[22]。這在我們課題組前期運(yùn)用鎂鍶合金修復(fù)犬頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)[23]。總而言之，鎂能夠促進(jìn)骨的修復(fù)與再生[24,25]。本實(shí)驗(yàn)所用鎂鍶合金膜(鍶1.5wt.%)具有300 MPa的抗壓強(qiáng)度，與骨皮質(zhì)的力學(xué)性能相近[26]，在一定程度上可滿足GBR技術(shù)中維持成骨空間所需的支撐能力。

從實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果中可以看出，A、B兩組屏障膜引導(dǎo)的骨再生實(shí)驗(yàn)區(qū)均充填新生骨組織，且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后12周X射線顯微鏡結(jié)果顯示，A、B兩組VOI區(qū)域的骨體積分?jǐn)?shù)基本相同，但A、B兩組骨體積分?jǐn)?shù)均高于C組；同時(shí)，A、B兩組實(shí)驗(yàn)區(qū)骨硬組織學(xué)切片均顯示出新生骨組織的替代、改建，這表明礦化膠原膜與鎂鍶合金膜兩組新生骨的密度與成骨量基本一致，鎂鍶合金膜表現(xiàn)出優(yōu)異的成骨活性。但在X射線顯微鏡觀察結(jié)果以及骨硬組織切片觀察結(jié)果中均未見鎂鍶合金膜及礦化膠原膜殘留的存在，說明本實(shí)驗(yàn)中鎂鍶合金及礦化膠原屏障膜已經(jīng)完全降解吸收，低于骨組織愈合所需時(shí)間(>12周)，材料的降解速率尚未與骨組織愈合過程相匹配。術(shù)后12周所有實(shí)驗(yàn)犬大體觀察和肝、腎組織以及實(shí)驗(yàn)區(qū)牙齦組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，A、B兩組材料實(shí)驗(yàn)區(qū)手術(shù)創(chuàng)口愈合良好，未見感染，各主要臟器及牙齦病理學(xué)標(biāo)本均顯示正常組織結(jié)構(gòu)，未見炎細(xì)胞浸潤，提示本實(shí)驗(yàn)所用鎂鍶合金膜對(duì)全身主要臟器和局部軟組織的安全性良好，具有良好的生物安全性。

總之，鎂鍶合金膜與礦化膠原膜相比，具有良好的生物安全性，且成骨效果無明顯差異，有望成為未來GBR技術(shù)屏障膜候選材料之一，但鎂鍶合金膜降解速率尚不能與骨組織愈合、再生進(jìn)程相匹配，今后還需對(duì)鎂基金屬材料耐腐蝕性進(jìn)行不斷優(yōu)化。