2 084例急性呼吸道感染患兒鼻咽分泌物中百日咳鮑特菌核酸檢測分析

陳楠，潘蕊，方玉蓮，王維，侯夢珠，林書祥

1天津市兒童醫院，天津300134；2天津市兒科研究所

百日咳是(Pertussis)由百日咳鮑特菌(B. pertussis)引起的具有高度傳染性的呼吸道疾病，在六個月以下的兒童中具有高度傳染性，其中三個月以下的嬰兒的百日咳住院率、出現并發癥和死亡的概率都是最高的。百日咳鮑特菌在疫苗接種出現之前，該疾病被普遍認為是一種兒科疾病，因為嬰兒和兒童的死亡率及發病率極高，但其實在孕婦和老年人人群中，出現可能危及生命的呼吸系統疾病的情況也非常嚴重，也需引起高度重視。盡管針對這種病原體的疫苗接種覆蓋率很高，但百日咳仍然是全球持續存在的公共衛生問題，也是全世界疫苗可控性最差的疾病之一。近年，即使是在接種了全細胞或無細胞疫苗的國家，百日咳也已重新出現，且發病率逐年升高[1～3]。且百日咳的流行模式已從過去的兒童-兒童模式轉變為現在的青少年(成人)-兒童模式[4,5]，嬰幼兒的感染主要發生在家庭中(75%～80%)，父母和兄弟姐妹是最常見的感染源。目前核酸擴增法如PCR是診斷百日咳非常敏感的方法，百日咳鮑特菌培養是常規的金標準方法，但實時PCR診斷百日咳所需時間更短，且靈敏度更高,需要鼻咽抽吸或拭子[6]。目前臨床尚未見百日咳鮑特菌IS481靶位進行百日咳鮑特菌的核酸檢測報道。為此，我們設計了百日咳鮑特菌IS481靶位的特異性引物，檢測急性呼吸道感染患兒鼻咽分泌物百日咳鮑特菌的感染情況。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年7月～2019年6月間天津市兒童醫院收治入院的急性呼吸道感染患兒2 084例。2 084例患兒中男1 298例(62.3%)、女786例(37.7%)，男女比例為1.65∶1；年齡為57時～72月(10.21±10.19)月。其中≤1個月307例(14.7%)，1～6個月605例(29.0%)，6～12個月795例(38.1%)，12～24個月246例(11.8%)，24～36個月101例(4.8%)、36～48個月22例(1.1%)，48～60個月4例(0.2%)，>60個月4例(0.2%)；均有明顯呼吸道感染癥狀。本研究經本院倫理委員會批準同意，納入者家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 百日咳鮑特菌核酸檢測方法 在2 084例住院患兒的鼻炎分泌物標本中吸取100 μL，按細菌總DNA提取試劑盒 (AXYGEN，美國)操作說明書進行DNA提取，操作過程嚴格按照說明書進行。提取出的細菌總DNA在-20 ℃保存備用。

運用PCR方法對百日咳桿菌插入序列IS481基因片段(長145 bp)進行擴增，根據文獻[7]合成引物序列Pertussis-IS481-P1 GATTCAATAGGTTGTAT-

GCATGGTT, Pertussis-IS481-P2 TGGACCATTTCGA-GTCGACG。每次PCR反應均設立陰性、陽性對照。

所有PCR擴增反應均在25 μL總反應體系中進行，5 μL模板，其他試劑參照試劑盒配制，用ddH2O補足。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，30個循環，72 ℃延伸5 min。凝膠電泳檢測擴增產物：用1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行分析，選取瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果陽性的PCR產物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 統計學方法 應用SPSS 20.0統計學軟件進行數據處理。計數資料以例(%)表示，采用χ2檢驗進行組間比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2 084份鼻咽抽吸物標本中百日咳鮑特菌陽性率為2.21%(46/2 084)。46份陽性樣本的PCR擴增產物經測序，將測序結果與Genbank數據庫中的序列進行比對分析，證明為百日咳鮑特菌。

46例百日咳鮑特菌陽性的患兒中男22例、女24例，二者性別比較差異具有統計學意義(χ2=4.186，P<0.05)。2 084份患兒鼻咽抽吸物標本中百日咳鮑特菌陽性檢出率分別為≤1個月2.0%(6/307)、1～6個月2.0%(12/605)、6～12個月2.3%(18/795)、12～24個月1.22%(3/246)、24～36個月1.98%(2/101)、36～48個月9.1%(2/22)、48～60個月50%(2/4)，>60個月25%(1/4)，各年齡段患兒中鼻咽抽吸物標本中百日咳鮑特菌陽性檢出率差異有統計學意義(χ2=58.163，P<0.05)。

2 084例患兒中，春、夏、秋、冬季各530、502、506、546例，鼻咽抽吸物標本中百日咳鮑特菌陽性率分別為1.9%(10/530)、2.0%(10/502)、4.2%(21/506)、0.9%(5/546)。不同季節呼吸道百日咳鮑特菌陽性檢出率間差異有統計學意義(χ2=13.428,P<0.05)。

3 討論

百日咳主要是由百日咳鮑特菌引起的一種傳染性極強的急性呼吸系統疾病，與5歲以下兒童咳嗽發作時間延長和死亡有關,以易感者吸入帶菌飛沫而被感染。與其他傳染病相比，百日咳是一種相對較新的感染性疾病[6]。

百日咳鮑特菌是一種可以引起百日咳或百日咳的呼吸道疾病的革蘭氏陰性短小桿菌，無鞭毛芽孢，專性需氧，最佳生長溫度為35 ℃～37 ℃。百日咳鮑特菌最初是由Bordet和Gengou在1900年觀察到并在1906年成功分離的[8]。腺苷酸環化酶毒素(CyaA)是百日咳鮑特菌產生的主要毒力因子之一。CyaA在百日咳鮑特菌的呼吸道定植的早期階段起重要作用[9,10]。該毒素使用原始的中毒機制：一旦被有毒細菌分泌，它便能夠通過獨特但鮮為人知的機制侵入真核靶細胞，導致細胞死亡。細胞中毒過程涉及直接跨靶細胞質膜的CyaA催化結構域易位的獨特機制。據統計所有年齡組都易受百日咳感染，其感染對成人可能癥狀較輕微，但對嬰兒有可能危及生命。且在未接種疫苗的嬰兒中，該疾病更為嚴重，其中可能發生驚厥，支氣管肺炎和腦病等致命性并發癥。本次研究中，共收集急性呼吸道感染患兒鼻咽抽吸物標本2 084份，使用百日咳鮑特菌IS481靶位的特異性引物進行檢測。其中百日咳鮑特菌陽性患兒46例，陽性患兒中男女比例約為1∶1。在各年齡組中，以6～12個月組陽性檢出例數最多，共18例，占全部陽性患兒的39.1%(18/46)；其次是1～6個月共12例，占全部陽性患兒的26.1%(12/46)；≤1個月6例，占全部陽性患兒的13.0% (6/46)。在一年的研究時段中，春、夏、秋、冬季標本中百日咳鮑特菌陽性檢出率分別為1.9%(10/530)、2.0%(10/502)、4.2%(21/506)、0.9%(5/546)。本次研究中，患兒鼻咽抽吸物標本百日咳鮑特菌陽性檢出率在不同性別、年齡段、發病季節間的差異有統計學意義。

近年來，引起百日咳的百日咳鮑特菌在全球范圍內重新成為一種重要的病原體。醫護人員以及公眾對這種疾病缺乏認識和臨床表達的差異性是文獻報道[6]的可能導致百日咳再次流行的原因。醫護人員和公眾仍然認為百日咳是僅會影響幼兒的疾病因而會導致它在成人患者中的診斷不足，因為在老年患者中不考慮這種診斷。同時，由于該疾病的臨床表達在很大程度上取決于相關人群的免疫水平，所以嬰兒、兒童、青少年和成年人之間百日咳的臨床癥狀也有所不同，這也可能影響對該疾病的診斷和治療。因此，對百日咳的持續關注和研究工作也顯得尤為重要。另外，百日咳主要通過免疫接種控制，但盡管疫苗接種計劃導致兒童死亡率持續下降，百日咳仍在繼續流行[11]。效力明顯下降的原因包括隨著時間的推移，免疫力下降，以及可能從突變的百日咳鮑特菌中“疫苗逃逸”，這可能會使其避免疫苗相關的免疫反應[12]。然而，疫苗接種仍然是最好的控制方法，因為抗生素治療僅在疾病早期有效[13]。監測目前流行的菌株對公眾的健康控制至關重要，既可以追蹤社區中百日咳鮑特菌的傳播，也可以為未來的疫苗開發提供急需的信息。

綜上所述，天津地區急性呼吸道感染患兒百日咳鮑特菌感染陽性率較高。