IVF-ET周期中2、4細(xì)胞卵裂球多核細(xì)胞發(fā)育情況及胚胎移植后妊娠結(jié)局觀察

陳磊，蔣如煜，王珊珊

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，南京 210008

單胚胎移植(SET)是降低多胎妊娠危險(xiǎn)性的重要手段之一。如何挑選最具發(fā)育潛力的胚胎，提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率是目前胚胎學(xué)家的研究重點(diǎn)。根據(jù)ESHRE共識[1]，分裂期胚胎評估的主要參數(shù)有第3天胚胎卵裂球數(shù)目及大小均一性、碎片、空泡等。最新研究[2]報(bào)道，受精第2天胚胎卵裂球單核可能是獨(dú)立反應(yīng)優(yōu)質(zhì)胚胎的新標(biāo)志。人類胚胎發(fā)育早期時(shí)卵裂球多核是一種常見現(xiàn)象。但第一次有絲分裂與第二次有絲分裂后出現(xiàn)的卵裂球多核通常被認(rèn)為是一種胚胎異常情況，50%以上的卵裂球多核胚胎是非整倍體、嵌合型及更加復(fù)雜的混合型，可降低IVF-ET周期中的囊胚形成率、種植率[3]。目前臨床評估胚胎形態(tài)學(xué)常采用倒置顯微鏡，卵裂球核狀態(tài)的評估受限。時(shí)差成像技術(shù)(TLI)可使胚胎學(xué)家獲取更多胚胎發(fā)育相關(guān)的細(xì)節(jié)性參數(shù)。TLI檢測的具有卵裂球多核的胚胎中，高達(dá)72.3%多核胚胎的在ESHRE/ALPHA共識規(guī)定時(shí)間范圍內(nèi)不能被識別[4]。目前，國內(nèi)針對胚胎卵裂球多核現(xiàn)象的研究大部分集中于4細(xì)胞階段，2細(xì)胞卵裂球多核是否影響胚胎發(fā)育的相關(guān)研究較少。因此，我們采用TLI動態(tài)觀察了卵裂早期卵裂球多核情況，評價(jià)其囊胚期胚胎質(zhì)量，探討2、4細(xì)胞卵裂球多核對胚胎發(fā)育及母體妊娠結(jié)局的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年3月～2017年10月間在南京鼓樓醫(yī)院殖醫(yī)學(xué)中心行IVF-ET的患者96例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡< 35歲；②基礎(chǔ)FSH<10 IU/L；③獲卵數(shù)5～15枚；④女方不孕原因均為盆腔輸卵管因素；⑤周期數(shù)< 2個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn):①存在部分或完全受精失敗周期史；②男性因素不育；③1～3C或2～5C出現(xiàn)異常分裂的胚胎者。患者均行IVF治療。納入者一般資料比較具有可比性，均簽署知情同意書。

1.2 體外受精及胚胎培養(yǎng) 采用常規(guī)促排方案[6]，B超監(jiān)測卵泡生成發(fā)育，待優(yōu)勢卵泡直徑18 mm以上，行陰道B超引導(dǎo)下卵泡穿刺獲卵。將獲得的卵冠丘復(fù)合體充分洗滌后放入IVF培養(yǎng)皿孵育3 h，與精子按1∶100 000的比例共孵育5 h，機(jī)械法剝除顆粒細(xì)胞，鏡下觀察到卵細(xì)胞第二極體釋放，判斷受精成功，受精成功后將卵細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含G1培養(yǎng)液的Slide皿中，置于Embryo Scope培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)到第3天。

1.3 卵裂早期卵裂球多核情況觀察 于受精(17±1)h時(shí)采用TLI系統(tǒng)鏡觀察胚胎卵裂早期卵裂球多核情況。本研究采用TLI系統(tǒng)是Embryo Scope(Vitrolife ，瑞典)[5]，整套系統(tǒng)包括三個(gè)部分：培養(yǎng)系統(tǒng)、分析軟件及耗材，拍照頻率10 min/次，可記錄胚胎發(fā)育過程中原核變化情況、卵裂方式與時(shí)間，專用培養(yǎng)皿為12孔皿。根據(jù)鏡下早期卵裂球核特征將其分為無多核胚胎(A組)、2細(xì)胞卵裂球多核者(2細(xì)胞一個(gè)卵裂球多核及4細(xì)胞無多核、2細(xì)胞均有多核及4細(xì)胞無多核胚胎，B組)、4細(xì)胞卵裂球多核者(2細(xì)胞一個(gè)卵裂球多核及4細(xì)胞至少一個(gè)卵裂球多核、2細(xì)胞均有多核及4細(xì)胞期至少一個(gè)卵裂球多核胚胎，C組)、2細(xì)胞無多核且4細(xì)胞至少一個(gè)卵裂球多核胚胎者(D組)。

1.4 囊胚期胚胎質(zhì)量評價(jià) 培養(yǎng)第3天評價(jià)各組胚胎質(zhì)量，計(jì)算各組培養(yǎng)第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率，培養(yǎng)第3天優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：8個(gè)≤細(xì)胞數(shù)≤10個(gè),卵裂球大小均勻，碎片<10%。 培養(yǎng)第5、6天根據(jù)ALPHA/ESHRE指南評價(jià)囊胚期胚胎質(zhì)量[7]，根據(jù)囊胚腔擴(kuò)張程度將囊胚分為1～6級，同時(shí)根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)大小與滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)劃分A～C級，本研究將囊腔擴(kuò)張?jiān)?級以上，且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)層不同時(shí)為C級的胚胎歸為可利用囊胚。培養(yǎng)第5、6天測算各組可利用囊胚率。

1.5 胚胎移植及妊娠結(jié)局觀察 在一個(gè)移植周期中，優(yōu)先挑選無卵裂球多核胚胎進(jìn)行移植。本研究中，如果患者一個(gè)周期中存在無卵裂球多核的胚胎且分裂方式正常，則優(yōu)選這個(gè)胚胎進(jìn)行移植，如果在一個(gè)周期中，僅有幾個(gè)分裂方式正常但都存在早期卵裂球多核，則優(yōu)先移植2細(xì)胞多核，4細(xì)胞無多核，且卵裂球多核數(shù)量越少越好，移植胚胎選擇順序?yàn)锳、B、C、D組。本研究移植的均為第3天分裂期胚胎。移植14 天時(shí)抽取患者空腹外周血，檢測血HCG>5 IU/L為生化妊娠，移植4～6周時(shí)B超下見孕囊及胎心為臨床妊娠。臨床妊娠者隨訪觀察妊娠結(jié)局。計(jì)算妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

共通過 TLI進(jìn)行培養(yǎng)96個(gè)周期，最終納入613個(gè)胚胎。613個(gè)胚胎根據(jù)卵裂早期卵裂球多核情況分為A組276個(gè)、B組160個(gè)(其中2細(xì)胞一個(gè)卵裂球多核及4細(xì)胞無多核胚胎73個(gè)、2細(xì)胞均有多核及4細(xì)胞無多核87個(gè))、C組140個(gè)及D組37個(gè)。培養(yǎng)第3天，A、B、C及D組優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為54.35%(150/276)、34.38%(55/160)、21.43%(30/140)及24.32%(9/37)，與其他各組比較，培養(yǎng)第3天，A組優(yōu)質(zhì)胚胎率最高(P均<0.05)；與B組比較，C組優(yōu)質(zhì)胚胎率降低(P均<0.05)。培養(yǎng)至第5天，A、B、C及D組可利用囊胚率分別為50.91%(84/165)、34.65%(44/127)、20.63%(23/128)、13.51%(5/37)，培養(yǎng)至第6天，A、B、C及D組可利用囊胚率分別為35.76%(59/165)、18.11%(23/127)、8.60%(11/128)、0(0/37)，培養(yǎng)至第5、6天，與其他各組比較，A組可利用囊胚率最高(P均<0.05)；與B組比較，培養(yǎng)第5、6天C組可利用囊胚率降低(P均<0.05)。

最終A組進(jìn)行72個(gè)周期胚胎移植，A組年齡(31.4±4.29)歲，BMI(22.46±3.11)kg/m2,基礎(chǔ)FSH(7.47±2.06)IU/L,基礎(chǔ)LH(4.84±2.14)IU/L,內(nèi)膜厚度(10.72±2.39)mm，獲卵數(shù)(11.36±2.55)個(gè)，移植成功率58.33%(42/72)，流產(chǎn)率7.14%(3/42)，活產(chǎn)率54.17%(39/72)。B組共進(jìn)行8個(gè)周期胚胎移植，其中2細(xì)胞一個(gè)卵裂球多核及4細(xì)胞無多核胚胎4個(gè)，移植者年齡(32.50±3.20)歲，BMI(20.76±1.71)kg/m2,基礎(chǔ)FSH(7.11±1.29)IU/L,基礎(chǔ)LH(6.77±2.12)IU/L,內(nèi)膜厚度(9.00±1.22)mm，獲卵數(shù)(12.37±2.48)個(gè)，3例患者種植成功，0例流產(chǎn)，3例均為活產(chǎn)；2細(xì)胞均有多核及4細(xì)胞無多核胚胎4個(gè)，移植者年齡(29.5±2.87)歲，BMI(21.90±1.89)kg/m2,基礎(chǔ)FSH(7.32±0.57)IU/L,基礎(chǔ)LH(9.73±5.08)IU/L,內(nèi)膜厚度(12.38±1.98)mm，獲卵數(shù)(10.62±1.98)個(gè)，4例患者種植成功，1例流產(chǎn)，3例活產(chǎn)。

3 討論

人類胚胎發(fā)育早期卵裂球多核是一種常見現(xiàn)象，約43.2%的胚胎在2細(xì)胞階段具有卵裂球多核現(xiàn)象[8]。因此胚胎卵裂早期卵裂球多核胚胎的發(fā)展?jié)摿κ悄壳暗难芯繜狳c(diǎn)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，多核化與非整倍體和染色體異常率的增加之間存在相關(guān)性[10]。部分早期卵裂球多核的胚胎在發(fā)育的過程中能夠進(jìn)行自我修復(fù)，減少多核帶來的不良影響，且多核胚胎有一半能發(fā)育到囊胚階段，超過20%的胚胎發(fā)育成形態(tài)學(xué)良好的囊胚[11]。而本研究結(jié)果顯示，B、C、D 組胚胎共培養(yǎng)292枚，其中第五天與第六天可利用囊胚共形成106枚，卵裂球多核胚胎囊胚可利用率達(dá)到36.30%，說明早期卵裂率球多核的胚胎具有一定的發(fā)育潛能，根據(jù)鼠胚染色體分離動力學(xué)研究[12]發(fā)現(xiàn)，早期胚胎分裂時(shí)紡錘體長度的變化可能在染色體分離中起著至關(guān)重要的作用，即在第1次有絲分裂時(shí)紡錘體長度明顯較第2次有絲分裂時(shí)短，染色體十分接近卵裂球中央位置，因此，胚胎完成第1次有絲分裂至2細(xì)胞階段時(shí)卵裂球多核現(xiàn)象的發(fā)生率明顯較高。本研究結(jié)果中，胚胎發(fā)育至2細(xì)胞階段多核率為48.93%，在胚胎繼續(xù)發(fā)育過程中4細(xì)胞階段卵裂球多核現(xiàn)象減少達(dá)到53.33%，同時(shí)相對于2細(xì)胞階段多核，4細(xì)胞階段多核胚胎在降低培養(yǎng)第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率和培養(yǎng)第5天囊胚可利用率方面，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明大多數(shù)胚胎在早期卵裂分裂期間具有更強(qiáng)的自我校正能力，且4細(xì)胞期卵裂球多核對胚胎發(fā)育的影響更廣[11]。

本研究結(jié)果同時(shí)顯示在2細(xì)胞階段，僅含單個(gè)卵裂球多核的胚胎的培養(yǎng)第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率和可利用囊胚率均高于雙卵裂球多核的胚胎，而Alikani等[14]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)第2天胚胎中，未觀察到多核的卵裂期胚胎的囊胚形成率要高于含有1至2個(gè)卵裂球出現(xiàn)多核的胚胎，兩者階段不一樣，但都說明了隨著多核的增加，胚胎的囊胚形成率降低。

最新研究[15]還提示隨著胚胎內(nèi)單核卵裂球的數(shù)目增多，胚胎的著床能力也會增加。除此之外，Hashimoto等[13]發(fā)現(xiàn)，如果胚胎第一次有絲分裂正常，其2細(xì)胞期出現(xiàn)的多核對胚胎的種植并不會產(chǎn)生影響，他們認(rèn)為2細(xì)胞期多核并不應(yīng)該成為胚胎移植刷選的排除因素，而4細(xì)胞期多核被認(rèn)為是胚胎移植的排除標(biāo)準(zhǔn)。本研究最終僅統(tǒng)計(jì)到8例多核胚胎移植者，其中4例2細(xì)胞期單個(gè)卵裂球多核，發(fā)育至4細(xì)胞期無多核的胚胎移植后3例臨床妊娠，另有4例2細(xì)胞期卵裂球均多核，發(fā)育至4細(xì)胞期均無多核的胚胎移植后，4例臨床妊娠，其中1例流產(chǎn)。表明早期卵裂球多核的胚胎能夠產(chǎn)生妊娠，但是由于本次研究例數(shù)較少，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在以后的研究中將一步擴(kuò)大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

綜上所述，2、4細(xì)胞卵裂球多核均可影響胚胎發(fā)育，且存在4細(xì)胞卵裂球多核的胚胎質(zhì)量更低，早期卵裂球多核胚胎也可以用于胚胎移植。早期卵裂球多核是胚胎發(fā)育過程中常見的現(xiàn)象，且隨著多核卵裂球數(shù)量增加，對胚胎發(fā)育的影響越大。TLI技術(shù)能夠詳細(xì)觀察到卵裂球多核現(xiàn)象，將早期卵裂球多核與胚胎形態(tài)學(xué)參數(shù)相結(jié)合，可用來臨床挑選最優(yōu)胚胎移植，來提高單胎活產(chǎn)率。