高粱耐冷基因全基因組鑒定及進化分析

張國琴，葛玉彬，張正英

（甘肅省農業科學院作物研究所，甘肅 蘭州 730070）

高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］是一種喜溫C4作物，具有生物產量高、抗旱、耐澇、耐鹽堿等特性，是干旱和半干旱地區重要的禾谷類作物。高粱春季播種后突遇低溫時常常使種子在土壤中“粉種”或霉爛，導致萌發率、出苗率降低，出苗后植株長勢較弱且生長緩慢，從而減少作物產量［1-2］。在高緯度溫帶地區，提早播期可延長高粱生長周期，增加生物產量，但早播遇到冷害的脅迫，種子不能發芽或者表現出較差的幼苗活力，限制高粱早期生長，降低生物量和產量，從而限制高粱在全球更多地區的推廣利用［3-4］。

許多植物通過低溫馴化增加耐冷性。關于在低溫脅迫下參與低溫調節和信號轉導的基因功能及特性的報道頗多。植物通過調節各種基因的表達來適應低溫脅迫，根據功能不同可將耐冷功能基因分為兩大類。一類是功能性基因，即合成膜脂相改變的基因，如不飽和脂肪酸的基因、提高細胞膜流動性基因等；另一類基因則參與整個信號傳導過程，在整個生理生化系統中起著調控作用，在模式作物擬南芥中轉錄因子CBF/DREB1蛋白家族和COR基因調控低溫誘導基因的表達，從而增加植物的耐冷性［5-6］。已鑒定出一些直接調控CBF基因的轉錄因子，例如激活型轉錄因子螺旋結構轉錄因子（ICE1）和鈣結合轉錄激活子（CAMTAs），以及抑制性型轉錄因子MYB15、EIN3和PIF3/4/7［7-9］；在水稻中已克隆的耐冷基因有Os－COLD1、OsSNAC2、OsDREB1B、OsqLTG3-1等［10-12］。我們通過NCBI、國家水稻數據中心等數據庫，對模式作物擬南芥和水稻中的耐冷關鍵基因進行搜集，并在高粱基因組中進行同源性比較，旨在為高粱耐冷候選基因的挑取提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料數據來源

利用NCBI數據庫、模式植物數據庫（www.modelcrop.org）搜索已報道的擬南芥耐冷基因，從國家水稻數據中心數據庫搜索水稻中已克隆耐冷基因和轉錄因子。登錄高粱全基因組蛋白數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome），從該網站下載所需的DNA和蛋白質數據。

1.2 高粱耐冷基因的鑒定

利用pfam數據庫（http://pfam.janelia.org/search/sequence）中的隱馬爾可夫模型（HMM）擬南芥、水稻耐冷基因結構域的氨基酸序列與高粱全基因組蛋白數據庫進行BLASTp序列比對，閾值小于等于1E-5，初步篩選出候選基因序列，得到候選序列后用Pfam 對結構域進行確認［13］。

1.3 創建高粱ARF基因家族進化樹

利用MEGA6.0軟件中的ClustalW，采用默認參數，對從高粱全基因組中搜索到的耐冷基因和模式作物耐冷基因蛋白的氨基酸序列進行多重比對，比對結果采用NJ（Neighbor-Joining）法構建系統進化樹，Bootstrap校驗值為1 000次。

2 結果與分析

2.1 模式作物耐冷基因的搜集

利用NCBI數據庫、模式植物數據庫（www.modelcrop.org）對已報道的擬南芥耐冷基因進搜索，結果如表1所示，搜集到的擬南芥主要耐冷基因有AtCBF1（AT4G25470）、AtCBF2（AT4G25480）、AtCBF3（AT4G25490）、AtICE1（AT1G12860）、 AtEIN3（AT3G20770）、AtAMP1（AT3G54720）等，分別編碼C-端脫水效應結合因子蛋白、堿性螺旋-環-螺旋DNA結合蛋白、乙烯不敏感蛋白、肽酶M28家族蛋白。從國家水稻數據中心數據庫搜索水稻中主要耐冷基因，搜索到OsCOLD1（Os04g51180）、 OsSNAC2（Os04g0460600）、OsqLTG3-1（Os03g0103300）、Osctb1（Os04g 0619300）、OsDREB1B（Os09g0522000）、Os DREB1F（Os01g0968800）等，分別編碼鳥嘌呤核苷酸結合蛋白、無頂端分生組織蛋白、未知蛋白、環氧氯丙烷相關蛋白、脫水效應元件結合蛋白。

2.2 高粱耐冷基因鑒定

通過BLASTp模式作物耐冷基因與高粱全基因組蛋白數據庫進行搜索，通過Pfam對結構域進行確認，結果如表1所示。鑒定出高粱的AP2家族（CBF1、CBF2、CBF3、DREB1B、DREB1F）基因有 203個、ICE1基因有252個、EIN3基因有15個、SNAC2基因有133個、AMP1基因有3個、COLD1基因有3個、qLTG3-1基因有53個、ctb1基因有90個。從結果中得出高粱全基因組中耐冷轉錄因子基因的拷貝數除EIN3乙烯信號通路中轉錄因子拷貝數少（13個），其余的拷貝數較多（AP2家族203個、ICE1 252個、SNAC2 133個）；耐冷功能型基因拷貝數較少（COLD1 3個、qLTG3-1 53個、ctb1 90個、AMP1 3個），這有助于為高粱耐冷候選基因的篩選提供依據。

2.3 高粱耐冷基因的進化研究

將鑒定出的高粱耐冷基因與模式作物相關基因利用MEGA6.0軟件構建系統進化樹，統計結果如表2所示，高粱全基因組的EIN3基因家族被聚為五大類，其中XP 002463411.2、 XP 002467935.1、 XP 0213 17527.1與擬南芥中AtEIN3親緣關系近，聚為一類，分布在高粱1號和2號染色體。高粱全基因組的AP2家族被聚為十五大類，其中XP 002457016.1、XP 021317625.1與擬南芥和水稻中AP2家族（AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、OsDREB1B、OsDREB1F）親緣關系近，聚為一類，分布在高粱3號和5號染色體。高粱全基因組的ctb1基因家族被聚為十三大類，其中 XP 002447111.1、XP 0213 15473.1、XP 002447110.1、XP 021318475.1、XP 021318476.1與水稻Osctb1親緣關系近，被聚為一類，分布在4號和6號染色體。高粱全基因組ICE家族被分為十大類，其中XP 002449576.1、XP 002459022.1與水稻中AtICE1親緣關系近，聚為一類，分布在高粱3號和5號染色體。高粱全基因組中的LTG3-1基因被分為十三大類，其中XP021312137.1與水稻中OsqLTG3-1親緣關系最近，聚為一類，分布在1號染色體。高粱全基因組中AMP1被分為2類，其中XP002466328.1與擬南芥AtAMP1親緣關系最近，聚為一類，分布在1號染色體。高粱全基因組中COLD1基因被分為二類，其中XP021317902.1與OsCOLD1親緣關系最近，聚為一類，分布在6號染色體。高粱全基因中SNAC2基因家族被分為十一大類，其中XP002446618.1、XP002452340.1、XP021314 112.1與OsSNAC2親緣關系最近，聚為一類，分布在3號、4號和6號染色體。分析以上結果，高粱中的與模式作物耐冷基因親緣關系近的耐冷基因主要分布在高粱1、2、3、4、5、6號染色體上，其中分布在1號和6號染色體上的最多，從而為找到高粱耐冷苗頭基因提供依據。

表1 模式作物耐冷基因及在高粱全基因組中拷貝數

表2 高粱中與模式作物耐冷基因系統進化結果統計分析

3 小結和討論

對已報道模式作物中部分耐冷基因及轉錄因子，通過對高粱全基因組進行掃描，得到高粱中的AP2（AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、OsDREB1B、OsDREB1F） 基因有203個，ICE1基因有252個，EIN3基因有15個，SNAC2基因有133個，AMP1基因有3個，COLD1基因有3個，qLTG3-1基因有53個，ctb1基因有90個。通過進化樹分析，得出在高粱中XP 002457016.1和XP 021317625.1與模式作物AP2基因家族親緣關系最近，分布在3號和5號染色體；XP 002463411.2、XP 002467935.1、XP 0213175 27.1與AtEIN3親緣關系最近，分布在1號和2號染色體；XP 002447111.1、XP 0213154 73.1、XP 002447110.1、XP 021318475.1 和XP 021318476.1與Osctb1親緣關系最近，分布在4號和6號染色體；XP 002449576.1和XP 002459022.1與Osctb1親緣關系最近，分布在3號和5號染色體；XP021312137.1與OsqLTG3-1親緣關系最近，分布在1號染色體；XP002466328.1與AtAMP1親緣關系最近，分布在1號染色體；P021317902.1與OsCOLD1親緣關系最近，分布在6號染色體；XP002446618.1、XP002452340.1、XP02 1314112.1與OsSNAC2親緣關系最近，分布在3號、4號和6號染色體。

目前高粱耐冷研究主要涉及QTL初步定位。但已定位QTL效應值足夠大的較少，還需要進一步研究驗證這些QTL的效應，還不能直接用于高粱早期耐低溫分子標記輔助選擇育種［3-4，14-15］，有必要通過其他方法加快高粱耐冷性研究，例如RNA-seq等，近年來，RNA-seq技術廣泛應用于植物應答低溫脅迫，水稻中，通過RNA-seq對耐冷型水稻轉錄組分析鑒定出121個低溫誘導基因，并且發現一個活性氧（ROS）-bZIP1調節子對早期低溫脅迫響應起著重要作用［16］；利用RNA-seq技術對2個甜玉米自交系在低溫脅迫進行轉錄組分析，分別鑒定出357和455差異表達基因，鑒定出與冷害響應共同差異表達基因94個，進一步分析發現74個差異表達轉錄因子，其中大多數參與新陳代謝和激素調節子［17］。我們對模式作物已報到的耐冷基因通過對高粱全基因組分析，得出在高粱全基因組中耐冷基因的苗頭基因及大概所在染色體分布，從而為高粱耐冷快速研究方法（RNA-seq、GWAS等）分析得到差異表達基因獲得目標耐冷候選基因提供依據。