2個枸杞品種的蛋白質提取與鑒定

張海燕，徐 煒，張立剛

（蘭州新區現代農業發展研究院有限公司，甘肅 蘭州 730300）

枸杞（Lycium barbarum）為茄科枸杞屬，別名枸杞菜、紅珠仔刺、牛右力、狗牙子、狗牙根、狗奶子，多分枝灌木，果實呈橢圓形或圓柱形，枸杞一般喜光照［1］。近年來，枸杞作為藥食兼用的名貴資源已為國內外學者所矚目，特別是國內許多學者對枸杞的化學成分、結構以及功能評價等方面進行了許多卓有成效的研究，并用現代醫學理論和化學方法研究了枸杞的化學成分及功能因子，尤其對枸杞多糖的提取分離、化學分析、藥理作用及臨床應用已具有較廣泛的研究基礎［2-3］。研究較多的另一大類活性物質為類胡蘿卜素，還有核黃素、維生素C、維生素B1、尼克酸、牛磺酸、17種氨基酸以及銅、鐵、鋅、錳、鎂、硒、鈣等多種微量元素，這些研究表明枸杞不僅營養豐富而且確實具有多方面的保健功能［4-5］。蛋白質是構成人體各組分的重要物質，枸杞中微量蛋白質也在枸杞功能中發揮著重要的作用，但與之相關的報道相對較少。寧杞1號為寧夏農林科學院從中寧農家品種大麻葉中采用單株選優方法選育而成［6］，是我國枸杞的主栽品種。蒙杞1號由內蒙古農牧科學院園藝研究所同內蒙古河套大學合作選育而成，有寸杞之稱，和寧杞1號（地產）相比果實體積增大1倍以上，特優級果率增加73%，果肉厚度增大28%，果實千粒重增加 994.9 g［7］。

我們采用鹽析、透析等方法，對蒙杞1號和寧杞1號中蛋白質進行提取，并利用蛋白質的SDS凝膠電泳技術測定2個枸杞中蛋白質的含量以及分析其電泳行為［8］，對枸杞中的蛋白質進行分析，以探索蛋白質含量與枸杞品質的關系，為枸杞品質鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試枸杞品種蒙杞1號由內蒙古農牧科學院園藝研究所提供，寧杞1號由寧夏農林科學院提供。

1.2 儀器設備

數顯恒溫水浴鍋，營養果蔬破壁養生機，海爾電冰箱，電子天平，TGL-16M高速低溫冷凍離心機（湘儀），超純水系統，凝膠成像系統，SHZ-88水浴恒溫振蕩器，多功能電磁爐，電泳儀，電泳槽，格蘭仕微波爐。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質的提取 將種子洗凈晾干，稱取蒙杞1號、寧杞1號各60 g，用破壁打漿機制漿，用紗布粗過濾，得到濾液。

1.3.2 鹽析 鹽析是指溶液中加入無機鹽類而使某種物質溶解度降低而析出的過程，蛋白質在自然環境中通常是可溶的，其表面大部分是親水基團，內部大部分是疏水基團。量取制漿后的枸杞液20 mL，分別根據體積計算出對應pH下的（NH4）2SO4量，如pH 6.0時，向其中加入（NH4）2SO4固體，使蛋白質溶液的（NH4）2SO4飽和度達40%，搖勻，再靜置2～3 h后6 000 r/min離心20 min，傾出上清液并向其中繼續加入（NH4）2SO4固體，使蛋白質溶液的飽和度達60%，搖勻，再靜置2～3 h后以8 000 r/min離心20 min，傾出上清液并向其中繼續加入（NH4）2SO4固體，使蛋白質溶液的飽和度達80%，搖勻，再靜置2～3 h后以8 000 r/min離心20 min棄去上清液。向3次離心后傾出上清液的離心管中加入0.02 mol/L pH 6.0的PBS緩沖液5 mL，輕輕搖動，使貼于管壁上的蛋白質溶解后置冰箱中保存。用同樣的方法對pH分別為7.0和8.0的枸杞蛋白提取液進行分級鹽析，最后制得Ma1（6.0，40%）、Ma2（6.0，60%）、Ma3（6.0，80%）、Mb1（7.0，40%）、Mb2（7.0，60%）、Mb3（7.0，80%）、Mc1（8.0，40%）、Mc2（8.0，60%）、Mc3（8.0，80%）9個蒙杞 1號蛋白樣液。用同樣的方法得到Na1（6.0，40%）、Na2（6.0，60%）、Na3（6.0，80%）、Nb1（7.0，40%）、Nb2（7.0，60%）、Nb3（7.0，80%）、Nc1（8.0，40%）、Nc2（8.0，60%）、Nc3（8.0，80%）9個寧杞1號蛋白質樣液。

1.3.3 透析 將2種蛋白質提取液分別裝入透析袋中，置于對應pH的0.02 mol/L PBS緩沖液中進行透析，每隔6～8 h換PBS緩沖液1次，連續透析64 h。

1.3.4 濃縮 將裝有蛋白質樣液的透析袋置于盛有聚乙二醇的培養皿中濃縮，直到蛋白質樣液體積為1 mL左右為止。

1.3.5 蛋白質的鑒定 將枸杞蛋白質與樣品緩沖液按體積比1∶1混合，加熱煮沸3 min，10 000 r/min離心，分離膠和濃縮膠的制備方法見表1［10］，然后進行十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）［9］、染色和脫色Ⅳ［11］，最后照相。

表1 分離膠和濃縮膠的制備方法

2 結果與分析

2.1 蒙杞1號電泳后條帶分布情況

由蒙杞1號蛋白質電泳圖譜（圖1）中條帶的寬度和顏色深度不一可知，每種蛋白的含量不同。在相同pH條件下，（NH4）2SO4濃度為40%時條帶顏色最深，（NH4）2SO4濃度為60%、80%時依次降低，（NH4）2SO4濃度為80%時幾乎沒有條帶。在相同（NH4）2SO4濃度下，pH為8時蛋白質條帶顏色最深。且每個泳道蛋白質條帶數不同，說明在不同條件下枸杞中蛋白質含量不同。

2.2 寧杞1號電泳后條帶分布情況

由圖2條帶的寬度和顏色的深淺不一可知，每種蛋白的含量不同。在相同pH下，（NH4）2SO4濃度為60%時蛋白質條帶顏色最深，（NH4）2SO4濃度為80%時幾乎沒有蛋白質條帶。在相同（NH4）2SO4濃度下，pH為6時蛋白質條帶最多；pH為7、8時蛋白質含量依次降低；pH為8時幾乎沒有蛋白質條帶。

2.3 2個品種電泳后分析

蒙杞1號在Na1（6.0，40%）的條件下，有蛋白質亞基7種；而寧杞1號在Na1（6.0，40%）即相同條件下，蛋白質亞基數為5。其余在相同條件下，除（NH4）2SO4濃度為80%外，蒙杞1號中蛋白質亞基數多于寧杞1號中蛋白質的亞基數。蒙杞1號在Ma1（6.0，40%）和 Mc2（8.0，60%）條件下蛋白質亞基數均為7，pH為8時蛋白質亞基數為0；寧杞 1 號在 Na1（6.0，40%）和Nb1（7.0，40%）條件下，蛋白質亞基數均為5，pH為8時蛋白質亞基數也為0。

3 結論

研究結果表明，枸杞中存在一定量的蛋白質。蒙杞1號中的蛋白質亞基多于寧杞1號。相同硫酸銨濃度，不同pH下，蛋白質亞基數不同。蒙杞1號在pH 6.0時蛋白質亞基數最多，即含量最多；pH 7.0、8.0時蛋白質亞基數依次減少，其中pH 8.0時幾乎沒有蛋白質，亞基數為0。寧杞1號在pH 7.0時蛋白質亞基數最多，蛋白質含量最多；pH 6.0時亞基數減少，蛋白質含量降低；pH 8.0時幾乎沒有蛋白質。在相同pH、不同硫酸銨濃度下，亞基數不同，即蛋白質含量不同。蒙杞1號在硫酸銨鹽濃度為40%時亞基數最多，蛋白質含量最多；硫酸銨鹽濃度為80%時蛋白質含量最少，亞基數為0。寧杞1號在硫酸銨鹽濃度為80%時蛋白質含量最少，幾乎沒有蛋白質；濃度在60%時相對較多，40%時亞基數最多，蛋白質含量最高。綜上可知，蒙杞1號在pH 6.0、硫酸銨鹽濃度為40%時提取效果最好，寧杞1號在pH 7.0、硫酸銨鹽濃度為60%時提取效果最佳。