表面活性劑雙水相萃取牛血清白蛋白的影響因素

王新剛，楊效益，孫永強，郭朝華，李 萍，李建波

（中國日用化學工業研究院有限公司，山西太原 030001）

蛋白質是由氨基酸組成的生物分子，在許多生物工程方面起著至關重要的作用，例如在生物技術方面，蛋白質在治療和診斷應用中具有重要價值［1］。蛋白質的功能取決于結構的穩定性，但是有聚合物、鹽或者有機溶劑存在時［2-5］，或者在高溫高壓操作條件下［6-7］，又或者是在調節pH的過程［8］中，蛋白質容易失去穩定性而導致功能喪失。因此，開發低成本、可持續而且可以保證蛋白質不變性的分離技術具有重要意義。蛋白質分離的常用技術包括沉淀、過濾、基于反膠束的分離、凝膠色譜、電泳等［9-10］，但是這些傳統方法往往存在操作步驟繁瑣、蛋白質產率低、需要大量有機溶劑等問題，致使不能實現蛋白質分離的規模化。

高分子水溶液在合適條件（如加鹽）下會發生相分離，形成的相分離體系被稱為雙水相體系（ASTP）。蛋白質等生物分子可以在平衡的兩相中都保持活性，但是在利用高分子雙水相體系萃取分離蛋白質時卻難以實現高分子的回收利用［11］，導致經濟成本較高。近年來，有相關研究報道，當陰陽離子表面活性劑在合適的濃度或以合適的比例混合時也會形成雙水相體系，并且可應用于蛋白質的萃取。與其他蛋白質分離工藝相比，陰陽離子表面活性劑形成的雙水相體系因溫度溫和、易于操作［12-13］、經濟、環境友好，被廣泛應用于蛋白質的分離和提取。

在探究窄分布脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（NAEnS，n=3，5，7，9）與陽離子表面活性十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）復配體系的表面行為時發現，聚氧乙烯基團（EO）加合數為5的窄分布脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（N-AE5S）與TTAB在復配過程中會形成雙水相體系。故本實驗探究了N-AE5S/TTAB雙水相體系中陰陽離子表面活性劑物質的量比、表面活性劑濃度對牛血清白蛋白（BSA）萃取率的影響，同時對萃取機理進行了初步研究。

1 實驗

1.1 試劑

窄分布脂肪醇醚硫酸鈉（烷基鏈長C12～14，實驗室自制），十四烷基三甲基溴化銨（分析純）、牛血清白蛋白Ⅴ（98%）（阿拉丁化學試劑公司），實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器

UV-1601紫外-可見分光光度儀（中國北分瑞利分析儀器有限公司），JEM-1011透射電子顯微鏡（日本JEOL公司），Zetasizer Nano-ZS90粒度電位儀（英國Malvern公司）。

1.3 標準曲線的繪制

配制不同質量濃度的BSA溶液，利用紫外-可見分光光度儀分別測定278 nm處的吸光度（以水為參比），并根據相應質量濃度下的吸光度繪制標準曲線。

1.4 測試

1.4.1 萃取率

配制N-AE5S/TTAB混合溶液（其中BSA質量濃度固定在1 mg/mL），于25 ℃下靜置72 h。同時為了避免其他因素的干擾，在相同條件下做空白實驗。待分層穩定后將萃取液和空白樣上層表面活性劑富集相稀釋50倍，以空白樣為參比測試在278 nm處的吸光度。根據下式計算萃取率：

其中，Vu和ρu分別是雙水相上層表面活性劑富集相的體積和BSA質量濃度，V和ρ分別是萃取體系的總體積和BSA質量濃度。

1.4.2 Zeta電位

配制0.1 mol/L N-AE5S/TTAB混合溶液，于25 ℃下靜置72 h，待分層穩定后利用粒度電位儀測定其上層表面活性劑富集相的電勢。

1.4.3 聚集形貌

將N-AE5S/TTAB溶液（物質的量比4.2∶5.8）快速混勻后，于25 ℃下靜置72 h，待分層穩定后取上層表面活性劑富集相，利用磷鎢酸進行負染色，24 h后利用透射電子顯微鏡觀察。

2 結果與討論

2.1 雙水相區域的確定

將0.1 mol/L N-AE5S溶液與TTAB溶液按照不同物質的量比混合配成總濃度為0.1 mol/L的混合溶液，快速混勻后于25 ℃下靜置72 h，待分層穩定后采用逐滴加水法確定N-AE5S/TTAB混合溶液雙水相形成的區域，結果如圖1所示。

圖1 N-AE5S/TTAB混合溶液在25 ℃下的相圖

由圖1可以看出，N-AE5S/TTAB混合溶液在物質的量比為3.8∶6.2～5.5∶4.5時均能形成ASTP，而且ASTP主要集中于陰離子表面活性劑N-AE5S過量區，只有一小部分存在于較高混合溶液濃度的陽離子表面活性劑TTAB過量區。同時，當N-AE5S/TTAB物質的量比為4.4∶5.6時，將混合溶液稀釋至7.79×10-3mol/L仍然能夠形成ASTP。

2.2 標準曲線的繪制

如圖2a所示，BSA在278 nm處存在較強的吸收峰，故將波長固定在278 nm，測定不同質量濃度BSA溶液的吸光度，然后根據測定結果繪制標準曲線，結果如圖2b所示。

圖2 0.6 mg/mL BSA溶液的紫外光譜圖(a)和標準曲線(b)

2.3 N-AE5S/TTAB雙水相體系對BSA萃取率的影響

2.3.1 表面活性劑濃度

如圖3所示，隨著表面活性劑混合溶液總濃度的增大，萃取率逐漸降低。Asenjo等［14］指出，隨著萃取劑分子質量的增大，萃取率逐漸降低。

圖3 N-AE5S/TTAB混合溶液濃度-萃取率關系圖

如圖4所示，隨著濃度的增大，ASTP上層表面活性劑富集相中的聚集體從球形聚集體轉變為交聯在一起且體積較大的網狀聚集結構。N-AE5S/TTAB混合溶液聚集體間的進一步聚集致使分子質量增大，萃取率逐漸降低。

圖4 N-AE5S/TTAB混合溶液上層表面活性劑富集相的聚集形貌

2.3.2 N-AE5S/TTAB物質的量比

如圖5所示，隨著N-AE5S在混合溶液中所占比例逐漸增大，萃取率逐漸降低直至為0%。當表面活性劑濃度為6.0×10-2mol/L、物質的量比為4.2∶5.8時，N-AE5S/TTAB混合溶液形成的ASTP對BSA的萃取率達66.05%。與傳統蛋白質萃取工藝相比，該萃取體系中水的質量分數為97%，可以減少萃取溶劑的使用量，降低了萃取成本。

圖5 N-AE5S/TTAB物質的量比-萃取率關系圖

隨著N-AE5S在混合溶液中所占比例的增大，混合溶液上層表面活性劑富集相的電勢逐漸降低，并從正值轉變為負值。而BSA的等電點為4.7［15］，萃取體系的pH為7，所以BSA在N-AE5S/TTAB混合溶液中顯負電性。結合圖6可知，在N-AE5S/TTAB混合溶液中形成的聚集體通過靜電相互作用與BSA結合在一起，而隨著N-AE5S在混合溶液中所占比例的逐漸增大，聚集體的正電性減弱，其與BSA間的靜電相互作用減弱，導致N-AE5S/TTAB混合溶液對BSA的萃取率逐漸降低。

圖6 N-AE5S/TTAB混合溶液萃取BSA上層表面活性劑富集相的聚集形貌

3 結論

（1）N-AE5S/TTAB混合溶液濃度固定在0.1 mol/L時，可以在物質的量比3.8∶6.2～5.5∶4.5內形成ASTP，且ASTP主要集中于N-AE5S過量區。

（2）當物質的量比固定時，隨著N-AE5S/TTAB混合溶液濃度的增加，ASTP中聚集體進一步聚集為較大的聚集體，致使BSA萃取率逐漸降低。

（3）當表面活性劑濃度固定時，隨著N-AE5S在N-AE5S/TTAB混合溶液中所占比例的增加，聚集體的正電性逐漸降低，致使其與BSA的靜電相互作用減弱，對BSA的萃取率逐漸降低。

（4）在濃度為6.0×10-2mol/L、N-AE5S/TTAB物質的量比為4.2∶5.8時，ASTP對BSA的萃取率達66.05%（以水為參比時，萃取率為92.85%）。