Tet-on 調控BMP-2 基因表達的腺病毒載體構建＊

溫家賓，肖裕華，陳鋼，李宇旭，龔飛鵬

（江西省人民醫院骨科，南昌 330006）

骨形態發生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)是一種高效的骨誘導生長因子，它能誘導未分化間充質細胞和骨髓基質細胞分化為成骨細胞，BMP-2 是BMP 家族中第一個確定具有誘導成骨作用的因子。 BMP-2 不僅可以直接促進成骨細胞的分化， 也能夠增加成骨細胞標志基因的表達，因此BMP-2 成為骨質疏松性骨折治療的重要靶點[1]。 由于蛋白類藥物在體內的半衰期短，藥物生物利用率低，作用于骨折部位的藥物濃度低。 因此， 尋求一種時效性的、 能在局部部位高表達BMP-2 的方法是治療骨折的關鍵[2]。 本研究擬通過構建帶有四環素（tetracycline，Tet）正向調控系統Tet-on 的BMP-2 基因腺病毒載體，利用四環素衍生物強力霉素與骨組織高親和性， 以及強力霉素在調控系統中起時間開關作用的兩大優勢， 為研究骨質疏松性骨折的基因靶向性、時效性、可調控的精確治療提供一種全新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料 含目的基因的pDC315-BMP-2 質粒由上海吉凱生物有限公司提供，DMEM 高糖培養基購自美國Gibco 公司， 胎牛血清購自美國Hycolon生物公司， 限制性內切酶Eco31I 購自立陶宛MBI公司，dNTP 購自美國 Promega 公司，Marker 購自北京天為時代生物公司，TaqDNA 聚合酶購自立陶宛MBI 公司，DNA 提取試劑盒購自上海生物工程有限公司，pAdenoX-Tet-On3GVector Adeno-X Rapid Titer Kit、StellarTM Competent Cells 購 自 美國 Clontech 公司，DNA Polymerase、DNA Extraction Kit、In-Fusion ?HD Cloning Kit、Plasmid Purification Kit 均購自日本Takara 公司，購自美國Clontech 公司，EndoFree Plasmid Maxi Kit 購自德國 Qiagen 公司。

1.2．方法

1.2.1 構建腺病毒表達質粒 以含有目的基因的pDC315-BMP-2 質粒為模板，將約1200bp 片段目的基因克隆至pAdenoX-Tet-On 3G Vector 中，構建Tet-on 腺病毒表達質粒。具體操作如下：引物設計遵循 Adeno -XTMAdenoviral System 3 User Manual 說明書進行。 使用 PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase（Takara Code No. R050A），以 pDC315-BMP-2 質粒為模板進行PCR 擴增。將PCR 產物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳后， 使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 （Takara Code No. 9762） 切膠回收目的約 1200bp 大小片段。 使用 In-Fusion? HD Cloning Kit ( Clontech Cat No. 639648 )， 將產物和 pAdenoX-Tet-On 3G Vector Set( Clontech Cat No. 631179 )連接。 使用EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen 貨號 12362)提取pAdenoBMP-2-Tet-On 表達質粒。 使用Thermo Fisher Nanodrop2000 超微量可見紫外分光光度計進行定量。

1.2.2 重組BMP-2 基因Tet-on 調控腺病毒 以含有目的基因的無內毒素腺病毒表達質粒為模板，制備單克隆重組腺病毒體。

1.2.2.1 Adeno-X 293 細胞培養 Adeno-X 293 Cell Line( Cat No.632271），培養基為 DMEM（10%FBS），培養條件為 37℃、5% CO2，培養箱中進行培養。 培養基 DMEM（10%FBS）具體配方：90% 高糖DMEM 培養基, 4 mM 左旋谷酰胺, 3.7 g/L 碳酸氫鈉以及10%不含四環素的胎牛血清。

1.2.2.2 腺病毒體制備 (1)轉染前pAdenoBMP-2-Tet-On 表達質粒溶液制備 在pAdenoBMP-2-Tet-On 表達質粒轉染細胞之前，重組質粒必須用Pac I酶進行消化處理， 用以暴露病毒的末端反向重復序列（inverted terminal repeats，ITRs），ITRs 位于病毒基因組末端， 包含了病毒DNA 復制的起始部分，也是構成復制復合體的重要組成部分，所以用PacI 消化暴露ITRs 制備出具有感染力的pAdenoBMP-2-Tet-On 表達質粒溶液是轉染前的關鍵步驟。 (2) pAdenoBMP-2-Tet-On 表達質粒轉染 Adeno-X 293 細胞。 在轉染前 24h，將 Adeno-X 293 細胞以 1-2×106cells 的密度鋪于 60mm 培養皿。培養條件為37℃、5% CO2，培養24h。觀察細胞鋪滿培養皿底約50%-70%，貼壁良好，用10μl 制備好的pAdenoBMP-2-Tet-On 表達質粒溶液轉染每個培養皿。 轉染后每天顯微鏡下觀察細胞病理現象（cytopathic effect，CPE)，判斷病毒是否轉染成功。 轉染1 周后，完成腺病毒初次擴增，PCR 鑒定擴增產物。

1.2.2.3 含有目的基因的重組腺病毒擴增、 純化及滴度檢測 在轉染前24h，將Adeno-X 293 細胞轉移至 T75 培養瓶中。 培養條件為 37℃、5% CO2，24h。 當細胞鋪滿瓶底達50%-70%時，將培養基移去， 重新每瓶中加入含有重組腺病毒的培養基5ml。 轉染條件為 37℃、5% CO2，90min。 移去培養基，重新加入10ml 新鮮培養基。 培養條件為37℃、5% CO2，3-4d。 觀察 CPE 現象，用 15ml 離心管收集細胞懸液。 用干冰將細胞液冰凍，然后在37℃水浴箱中解凍，反復3 次，分離病毒。 利用Adeno-X Rapid Titer Kit 檢測病毒滴度。

2 結果

2.1 目的基因的提取 以含有 BMP-2 基因的pDC315-BMP-2 質粒為模板，提取出約1200bp 片段基因（圖 1）。

圖1 對pDC315-BMP-2 質粒酶切后成功獲得1233bpBMP-2 基因片段（產物1）

2.2 目的基因導入 pAdenoX-Tet-On 3G Vector將 BMP-2 基因片段導入 pAdenoX-Tet-On 3G Vector, 經轉染培養后重新酶切產物， 所得質粒（CTG083-2A-10） 測序結果與參考序列完全相同（圖2）， 表明目的基因成功和腺病毒Tet-on 載體連接。

圖2 Pac I 酶消化后得到特征DNA 條帶

2.3 重組腺病毒轉染細胞，擴增及滴度測定 重組腺病毒轉染Adeno-X 293 細胞后， 觀察到CPE 現象（圖 3），同時，培養7d 后細胞裂解產物 PCR 產物分析含有目的基因質粒的特征條帶（圖4）。重組BMP-2 基因Tet-on 腺病毒擴增純化后滴度測定結果：

CTG083-P4 Adenovirus (2014.01.02)，1000ul，6x109ifu/ml

圖3 病毒轉染7 天后，細胞出現CPE 現象，鏡下觀察細胞聚合，為腺病毒感染典型特征

圖4 重組腺病毒轉染細胞后，培養1 周取細胞裂解產物行3%瓊脂凝膠電泳，表明重組腺病毒所含目的基因成功轉入細胞內

CTG083-P4 Adenovirus (2014.01.06)，1100ul，1x1010ifu/ml

3 討論

骨質疏松性骨折是骨質疏松癥(osteoporosis，OP)最嚴重的并發癥，它嚴重危害老年人健康。 由于老年人一般情況差，基礎疾病多，骨質疏松程度重，骨折后往往愈合能力差，治療時間長且伴隨風險及死亡率高，給患者、家庭和社會都帶來了沉重的負擔[3,4]。 因此，如何“又快又好”的治療老年人骨質疏松性骨折無疑是一項十分具有挑戰性的課題。 研究發現，在老年骨質疏松癥患者松質骨中，BMP-2 基因表達水平較正常成年人顯著降低，證明BMP-2 與老年性骨質疏松骨折的發病有著密切的聯系[5]，同時，BMP-2 基因的表達水平與骨質疏松性骨折發生后的愈合過程有著重要的的相關性，在骨折愈合的過程中，BMP-2 表達顯著升高[6]。

目前,基因治療骨質疏松性骨折是一個新興的熱點，如構建重組BMP-2 基因腺病毒或慢病毒載體，進而轉染細胞以及骨折部位局部注射，提高局部BMP-2 表達水平，進而促進骨折愈合，已經表明可以成為骨質疏松癥骨折基因治療重要方法[7,8]。但是，對于骨質疏松性骨折而言，其骨折愈合過程中關鍵的血腫機化期和原始骨痂形成期持續約1-2 個月，其后主要通過功能鍛煉達到骨痂改造塑行的目的。 如果BMP-2 基因表達沒有在時間上受到調控， 則其在血腫機化演進期和原始骨痂形成期可能表達不足，導致骨折延遲愈合，而骨痂改造塑行期若過度表達,又可能導致骨折的畸形愈合。 同時，如果沒有在骨折部位上進行靶向調控，BMP-2基因將不僅僅在骨組織中表達， 也可能會在骨外組織表達而造成異位骨化[9,10]，甚至導致腫瘤[11,12]發生。 所以，如何進一步對BMP-2 進行嚴密、特異、時效性地靶向調控， 成為了進一步研究的重要方向[13,14]。

Tet-on 系統是目前應用廣泛的四環素表達正向調控系統[15]，在沒有四環素衍生物強力霉素（doxycycline，Dox）存在時，下游目的基因轉錄被抑制；加入強力霉素后，下游目的基因得到表達，可以利用強力霉素的開關作用，起到時效性調控的作用。而且，人們發現作為Tet-on 系統“鑰匙”的強力霉素具有明顯的“骨組織親合性”，可以和羥基磷灰石結合，組成強力霉素緩釋系統，形成強力霉素在骨組織的長期緩慢釋放， 具有骨靶向性調控的作用[16]。 在 Zeng 等人的研究中，成功利用 Tet-on 系統調控攜帶COLIA1 基因的腺病毒時效性、靶向性表達促進骨質疏松骨折大鼠愈合， 證明了Tet-on系統對于骨折愈合基因調控的兩大優勢[17]。

基于以上治療方法及發現的問題， 本次研究成功構建Tet-on 調控BMP-2 腺病毒載體，利用強力霉素與骨組織高親和性和強力霉素在基因調控系統中開關作用的兩大優勢， 為后期進一步的體外及體內試驗奠定了基礎。 該重組腺病毒載體的構建成功，將可能使轉染后的BMP-2 基因不但能在骨組織中靶向表達， 而且能在血腫機化演進期和原始骨痂形成期時多表達， 而骨痂改造塑行期少表達，達到時效性、靶向性基因治療改善骨質疏松性骨折愈合作用機制的目的， 同時減少相應的副反應，為骨質疏松性骨折的治療，提供了一個全新的思路。