C-erbB-2和Ki-67表達陽性及陰性的乳腺癌超聲造影定性及定量參數對比觀察

徐平，楊敏，劉勇，吳蘭英

首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京100038

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，患病率和病死率均呈上升趨勢，早期預測患者的預后有助于制定個體化治療和檢測治療效果[1]。近年臨床發現了很多可預示乳腺癌臨床預后的生物學指標。C-erbB-2，也稱為HER-2，是人類表皮生長因子受體家族的成員，可用作乳腺癌的診斷及指導治療標志物[2, 3]。Ki-67是臨床檢測癌細胞增殖活性的敏感指標，可用于評估腫瘤細胞的增殖狀態[4]。但目前臨床檢查癌組織C-erbB-2、Ki-67表達的方法是有創的，患者耐受性較差。超聲檢查可以對乳腺病變進行分析，超聲造影(contrast-enhanced ultrasound ,CEUS)以一種非侵入方法觀察微小血管的變化，評估腫瘤的血管生成。乳腺的良惡性病變在CEUS中表現均不同[5, 6]，而不同程度的癌性病變組織中C-erbB-2、Ki-67表達情況也不同。因此，我們分析不同C-erbB-2、Ki-67表達的乳腺癌患者癌組織CEUS病變參數變化，旨在為乳腺癌的治療和預后評估提供新的依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月～2019年6月在我院治療的乳腺癌患者88例，年齡31～74(50.40±9.22)歲。納入標準：①均經病理學確診為浸潤性導管癌；②女性患者；③單發病灶；④CEUS檢查前未行放化療等抗腫瘤治療；⑤患者及家屬知情同意。排除標準：①合并有其他惡性腫瘤者；②有急慢性感染、免疫系統疾病、血液系統疾病等其他疾病者。本研究經本院倫理委員會批準同意。

1.2 癌組織C-erbB-2、Ki-67檢測 采用免疫組化染色法。取88例患者乳腺癌組織標本。固定于10%甲醛溶液中，制作常規石蠟切片，厚5 μm，HE染色。免疫組化試劑分別是兔抗人C-erbB-2和Ki-67多克隆抗體(購自福州麥新公司)。用SP法進行染色，加DAB進行顯色，最后在顯微鏡下觀察。陰性對照則用磷酸鹽緩沖液代替一抗。每個切片選取10個高倍視野，每張切片由2人雙盲觀測，判斷標準[7，8]：癌細胞的細胞核染成棕黃色比例≥14%為 Ki-67表達陽性、<14%判為陰性。C-erbB-2以 SP 染色后細胞膜出現棕色顆粒著色陽性細胞數≥10%為+，著色陽性細胞數≥20%為 ++，著色陽性細胞數≥30%為 +++，其中“-”或“+”判為C-erbB-2表達陰性、“++”、“+++”判定為陽性。

1.3 乳腺癌患者CEUS檢查方法 使用GE E9超聲檢查儀，患者仰臥位，使用9L線陣探頭對乳房進行掃描，測量腫瘤最大徑線。超聲造影劑使用Sonovue。造影劑用5 mL生理鹽水稀釋后經肘靜脈團注，用量為4.8 mL。選擇病變血流最豐富的切面進行超聲造影檢查，至少持續3 min。觀察乳腺癌造影劑的顯像情況，并進行定性分析，獲得下列定性參數：增強時間(快進、同進或晚進)、增強均勻性(均勻、不均勻)、增強范圍(達峰后擴大、無擴大)、增強邊緣(清晰、不清晰)、充盈缺損(有、無)；同時在病變增強強度最高的地方進行圓形取樣，獲取感興趣區域的時間強度曲線，獲得下列定量參數：峰值強度、達峰時間、曲線下面積。

2 結果

88例乳腺癌患者中C-erbB-2、Ki-67陽性表達分別為52、70例，陰性表達分別為36、18例。

C-erbB-2陽性、陰性表達者年齡分別為(49.39±8.28)、(51.03±9.80)歲，腫瘤直徑分別為(2.10±1.03)、(2.02±1.18)cm，陽性患者TNM分期Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期分別為13、30、9例，陰性患者分別為11、19、6例。二者年齡、腫瘤直徑及TNM分期比較差異無統計學意義。CEUS定性參數中，C-erbB-2表達陽性的乳腺癌患者表現為快進灌注、不均勻性增強、增強后病灶范圍擴大、增強后邊界不清晰、有充盈缺損例數分別為44、31、36、34、24例，C-erbB-2表達陰性者分別為19、21、23、22、18例，C-erbB-2表達陽性的乳腺癌患者快進灌注比例高于陰性表達者(P<0.05)。CEUS定量參數中，C-erbB-2陽性、陰性表達者峰值強度分別為(19.28±5.00)、(16.05±4.09)dB；達峰時間(13.30±2.39)、(15.19±2.31)s；曲線下面積分別為935.83±331.79、723.26±227.50。與陰性表達者比較，C-erbB-2陽性表達者峰值強度和曲線下面積高，達峰時間短(P均<0.05)。

Ki-67陽性、陰性表達者年齡分別為(51.02±8.92)、(49.40±9.10)歲，腫瘤直徑分別為(2.05±1.19)、(2.09±1.10)cm，陽性患者TNM分期Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期分別為18、40、12例，陰性患者分別為6、9、3例。二者年齡、腫瘤直徑及TNM分期比較差異無統計學意義。CEUS定性參數中，Ki-67表達陽性的乳腺癌患者表現為快進灌注、不均勻性增強、增強后病灶擴大、增強后邊界不清晰、存在充盈缺損例數分別為51、42、46、44、38例，Ki-67表達陰性者分別為12、10、13、12、4例，Ki-67表達陽性的乳腺癌患者有充盈缺損比例高于陰性表達者(P<0.05)。CEUS定量參數中，Ki-67陽性、陰性表達者峰值強度分別為(18.67±3.22)、(15.99±4.03)dB；達峰時間(13.82±2.21)、(15.04±2.07)s；曲線下面積分別為825.10±304.42、742.29±308.83。與陰性表達者比較，Ki-67陽性表達者峰值強度和曲線下面積高，達峰時間短(P均<0.05)。

3 討論

乳腺癌的生物學行為和組織病理學改變是圖像診斷的基礎，如何通過無創成像技術直接或間接客觀地反映乳腺癌的預后因素，以及探索影像學表現與乳腺癌的預后因素之間的關系一直是國內外醫務工作者的方向[7]。乳腺癌病變中異常分子的表達、微環境的變化以及腫瘤細胞的相互作用可導致組織的病理變化，從而導致影像中的獨特表現[8]。常規超聲及超聲造影的表現均可能與分子免疫組化指標相關。

C-erbB-2與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGR)有一定相似性[9]。當C-erbB-2表達增多時會發揮VEGR樣活性以促進微血管生成，使腫瘤繼續生長和轉移[10]。峰值強度表示在整個成像過程中達到最高峰時造影劑的強度，與病變內微血管密度相關；曲線下面積表示從初始強度的初始增強到最后增強的面積之和，可間接反映病變組織的血流量[11]；達峰時間代表從開始到達到最大峰值強度所花費的時間，短的達峰時間與異常血管形成相關，以上三個CEUS的灌注參數均與腫瘤血管生成的密度、程度和血流的灌注量有關。

本研究中我們采用癌組織免疫組化檢測和CEUS來觀察乳腺病變，結果表明，C-erbB-2陽性患者的快進灌注比例、峰值強度和曲線下面積較陰性者高，其達峰時間也較快。C-erbB-2的表達量越多，促使病變中的微血管密度越高，由于缺乏肌肉層，新血管形成較薄且容易變形，動靜脈瘺易于形成，造影劑進入C-erbB-2陽性表達腫瘤的時間比周圍正常的組織短，CEUS表現為定量分析短的達峰時間，定性分析為“快進”模式。

除了C-erbB-2與CEUS征象相關外，本研究還發現Ki-67陽性者有充盈缺損比例、峰值強度和曲線下面積高于Ki-67陰性者，而達峰時間明顯快于陰性者。原因是Ki-67是與腫瘤細胞增殖相關的蛋白，表達越高，癌細胞增殖越快，Ki-67的表達加速了血管的生成過程[12]，致使病變組織中產生了不規則的滋養血管和血管內皮細胞，腫瘤中微血管密度更高，CEUS出現高峰值強度；腫瘤單位體積中的平均血流增加，CEUS定量分析時曲線下面積增大；乳腺癌對周圍正常乳房組織的侵襲性增大，病灶周圍信號增強[13]，同時，腫瘤的周圍產生更多的腫瘤微血管，并且破壞了周圍組織的抗侵襲屏障，這使其不斷滲入周圍組織[14]。惡性病變的邊緣區域具有高度的增殖活性，并且生長模式通常以對周圍正常乳腺組織的“蟹腳狀”侵入性生長的形式。由于腫瘤微環境而導致“蟹足”浸潤部分。腫瘤細胞的作用和相關腫瘤細胞的相互作用導致腫瘤細胞分泌大量的VEGF，從而引起病變周圍大量的新生血管形成，CEUS增強后病灶面積增大[15]。Ki-67表達的乳腺癌病變微血管錯綜復雜，分布不均且曲折，腫瘤微血管形成跟不上腫瘤的生長速度，使得腫瘤組織的血供不足[16]，由于營養供應不足和缺氧，腫瘤的局部區域易于液化和壞死，CEUS表現為充盈缺損。

本研究分析了乳腺癌灶中C-erbB-2和Ki-67的表達與CEUS定性、定量參數的關系，并分析了兩者之間的相關性。CEUS將在定量分析的基礎上展示更多的臨床應用前景。然而，關于血管造影特征與C-erbB-2和Ki-67的表達相結合的研究很少，因此需要進一步探討其生理和病理過程。簡而言之，將CEUS技術用于乳腺癌可以幫助影像醫師使用超聲來預測乳腺癌病情，減少患者的侵入性臨床操作，為制定合理的治療計劃提供有用的信息。

綜上所述，乳腺癌CEUS參數中快進增強、峰值強度、曲線下面積及達峰時間可能與C-erbB-2陽性表達相關，有充盈缺損、峰值強度、曲線下面積和達峰時間可能與Ki-67陽性表達相關。因此CEUS檢查可作為一種輔助檢查指導乳腺癌患者的治療及評估預后。