超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜測定飼料中喹烯酮方法探究

袁艷茹

（安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗(yàn)中心，河南安陽 455000）

喹烯酮是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制，農(nóng)業(yè)部于2003年8月批準(zhǔn)用于抗菌促生長國家一類新獸藥。喹烯酮具有促進(jìn)動物生長，也有廣譜抗菌性。此外喹烯酮無其它喹喔啉二氧化物急性、慢性、蓄積性毒性和致畸、致癌、致突變副作用[1]。因此喹烯酮被廣泛用于畜牧養(yǎng)殖中。獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2017版規(guī)定喹烯酮用于豬飼料時每1000 kg不超過50g（以喹烯酮計(jì)），禁用于禽和體重35 kg以上的豬。近年來隨著喹烯酮研究不斷深入，研究表明，喹烯酮用量增加時，具有一定遺傳毒性[2]。實(shí)際飼料生產(chǎn)和動物養(yǎng)殖中，喹烯酮超量添加和非法使用現(xiàn)象時有發(fā)生，這就需要對畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的加強(qiáng)，對喹烯酮濫用及違法使用從源頭控制。液質(zhì)聯(lián)用法是目前飼料中喹烯酮測定應(yīng)用較廣泛方法，皆因這種方法較其他方法具有靈敏度高、選擇性好、檢出限低，定性定量準(zhǔn)確特點(diǎn)。本文方法也具有上面液質(zhì)法特點(diǎn)，此外分離度更高，分析速度更快。本文就是基于這種方法對飼料中喹烯酮檢測原理，前處理過程、測定過程及結(jié)果計(jì)算就行了探究。

1 原理的探究

本文采用甲酸乙腈溶液為提取液，既可沉淀蛋白又可提取在這種溶液中溶解喹烯酮，之后超聲提取。因親水親脂HLB固相萃取柱具有不怕干涸，pH應(yīng)用范圍廣，親水結(jié)構(gòu)有利于保留極性物質(zhì)，不會吸附堿性物質(zhì)，用料很少及回收率高的優(yōu)勢，用HLB固相萃取柱凈化，氮吹濃縮，再用乙腈溶液溶解，之后上超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜測定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)液外標(biāo)法定量。

2 前處理過程探究

因喹烯酮對光敏感，全過程應(yīng)避光！

準(zhǔn)確稱取一定量飼料樣品（空白樣品、用作添加的空白樣品、樣品）分別于50 ml離心管中，同時準(zhǔn)備試劑空白管。用作添加空白樣品里加入一定量喹烯酮儲備液作為陽性添加樣品。每個管中加入60% 0.1%甲酸乙腈溶液10 ml，高速渦動1 min，40 ℃超聲提取10 min，充分提取喹烯酮到液體中。10000 r/min離心 13 min，使液體中喹烯酮與飼料固體分離，收集上清液。用提取液重復(fù)提取一次，可使喹烯酮達(dá)到完全提取目的，合并兩次提取液混勻，為總提取液。準(zhǔn)確移取5 ml總提取液于60 ℃氮吹至 2 ml，之后加入 0.1 mol/L 磷酸二氫鉀溶液 4 ml，充分渦動溶解，為備用液。

準(zhǔn)備好HLB固相萃取柱，依次用3 ml甲醇活化，3 ml水平衡，備用液全部過柱，之后依次用0.02 mol/L鹽酸 3 ml、5%甲醇3 ml淋洗，主要洗掉一些堿性雜質(zhì)和極性有機(jī)雜質(zhì)，之后擠干。然后用純甲醇5 ml洗脫并擠干，收集洗脫液，把喹烯酮用純有機(jī)溶劑從柱子上洗脫下來。60 ℃氮吹至干，濃縮喹烯酮。最后加入20%乙腈充分渦動溶解，為凈化液。過濾膜待上機(jī)。

由于喹烯酮受基質(zhì)影響較大，因此用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液外標(biāo)校準(zhǔn)樣品。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液制備參見農(nóng)業(yè)部2086號公告-5-2014[3]。因超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜儀靈敏度很高，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液最高濃度點(diǎn)不宜超過100 ng/ml。實(shí)際測定過程中，對于超出最高濃度點(diǎn)的樣品，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液應(yīng)與樣品同步稀釋，這樣重復(fù)性和回收率比較好。

3 分析測定過程的探究

色譜柱：BEH C18柱，柱長 5 cm，內(nèi)徑 2.1 mm，粒徑 1.7 μm，超高效液相色譜柱體現(xiàn)內(nèi)徑小、粒徑小，這種方法有高分離度，高靈敏度、快分析速度。流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序?yàn)椋浩鹗紶顟B(tài)A為6%、B為94%；2.5 min時A為15%、B為85%；3.0 min時A為100%、B為0%；4.0 min時A為100%、B為0%；4.5 min時A為6%、B為94%。流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：2 μL。色譜柱柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測，3.0 kV毛細(xì)管電壓，500℃脫溶劑溫度，150℃離子源溫度，150 L/h錐孔氣流速，1000 L/h脫溶劑氣流速，定性、定量離子對以及它們的錐孔電壓、碰撞能量為307.16＞131.069、40V、26eV；307.16＞143.093、40V、30eV。

定性定量測定時，離子對選擇，保留時間偏差，定性離子確證允許偏差參見農(nóng)業(yè)部2086號公告-5-2014[3]。試劑空白和樣品空白不能出現(xiàn)與陽性添加樣品相同定性定量離子對的色譜峰。

4 結(jié)果計(jì)算的探究

結(jié)果計(jì)算參見農(nóng)業(yè)部2086號公告-5-2014[3]。對于超過標(biāo)準(zhǔn)液最高點(diǎn)陽性樣品，需要稀釋，計(jì)算時乘以稀釋倍數(shù)。此外陽性添加樣品需要計(jì)算回收率，陽性添加樣品測定含量與實(shí)際添加含量的百分比為回收率。回收率主要反應(yīng)分析方法的合適性和幫助分析人員分析操作過程，以確保分析結(jié)果準(zhǔn)確。此外還需要計(jì)算出兩次獨(dú)立測定結(jié)果相對偏差。

5 結(jié)語

本文用超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜測定飼料中喹烯酮進(jìn)行了幾方面探究，通過研究，這種方法更加清晰明了，對從事這方面檢測工作者提供了一個參考。這種方法具有特點(diǎn)必使這種方法成為以后飼料中喹烯酮檢測趨勢，也為更好監(jiān)測飼料中非法添加和超量使用喹烯酮提供了便利。