環狀RNA及其對腫瘤作用的研究進展

劉建林,趙小蓉,汪萍,劉康,別俊

1川北醫學院,四川南充 637000;2南充市中心醫院

環狀RNA(circRNA)是一類由mRNA 3′及5′末端首尾相連形成的無蛋白編碼功能的RNA分子，主要由內含子或外顯子通過反向拼接或套索內含子的方式產生[1]。長期以來，限于檢測技術的制約，circRNA被認為是轉錄后加工過程中的錯誤產物，并未引起重視。隨著測序技術的發展，發現circRNA廣泛存在于真核細胞中，且穩定表達，在人類細胞基因表達調控中起重要作用[2]。目前研究表明，circRNA在很多腫瘤中存在異常表達，且與腫瘤分期及類型存在相關性[3]，提示其在腫瘤發生發展過程中發揮重要的調控作用，有望為腫瘤的診斷、治療提供新的思路。circRNA在腫瘤中的作用已成為非編碼RNA家族中新的研究熱點。現對circRNA的形成機制、生物學特征、功能及其在腫瘤中作用等方面進行闡述。

1 circRNA

1.1 形成分類及特征 circRNA主要有內含子環化和外顯子環化兩類形成方式。根據生成合成機制circRNA可以分為三種類型：外顯子circRNA、內含子circRNA和外顯子—內含子circRNA。目前成環機制有：在mRNA前體上，連續的組裝小核糖體蛋白催化外顯子下游的5′供體位點連接到上游的3′受體位點，首尾插接形成環化，通過剪切形成circRNA；部分circRNA外顯子兩側內含子中含有反向互補序列，在剪切位點上形成RNA雙鏈，通過可變剪切形成帶內含子和不帶內含子兩種circRNA；RNA結合蛋白(RBPs)是一類涉及基因轉錄和翻譯的蛋白，是circRNA的基本功能元素，通過將RPBs結合到外顯子側翼的內含子上，促進circRNA的形成。不同于線性RNA，circRNA是共價閉合的單鏈環狀RNA分子，無5′帽和3′poly(A)尾巴。這種結構特征使得circRNA對核糖核酸酶[如核糖核酸外切酶R(RNase R)和核酸外切酶]的消化具有抗性，相比線性mRNA的穩定性更高、半衰期更長[4]。此外，研究還發現，circRNA多由外顯子組成，少數由內含子環化形成，在物種間進化上具有高度保守性[5]；且在一定組織細胞來源及不同發育階段中具有時序特異性[6]。

1.2 功能 研究發現circRNA可充當miRNA海綿，從而發揮生物學作用[7]。circRNAs是一類競爭性內源RNAs，可以與miRNA結合而在轉錄后水平上影響miRNAs的穩定性和轉錄，導致miRNA相關靶基因表達水平發生改變[8,9]。同時circRNAs通過多種途徑參與調控基因轉錄。研究發現，部分外顯子—內含子circRNA可以與U1小核糖核蛋白(snRNP)相互作用，通過與RNA聚合酶Ⅱ結合，促進親本基因轉錄[10]。剪接因子外顯子可以環化形成circRNA，它與前體mRNA的線性剪接競爭，影響線性RNA的形成，起到調節相關基因表達的作用。此外，circRNA作為非編碼RNA，被認為無法依靠帽子相關翻譯機制進行翻譯，并且，先前的多核糖體梯度分析和核糖體譜分析表明，大多數circRNA與多核糖體無關。然而最近一些研究通過構建了一個包含無限閱讀框的環狀RNA，證明這種circRNA可以模仿原核生物中RNA翻譯進行DNA滾環擴增(RCA)[11]，這提示circRNA可以編碼蛋白質，具有翻譯功能。

近來研究發現，circRNA參與細胞信號傳導途徑，例如促分裂原激活蛋白激酶/細胞外調節蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B和Wnt/β-catenin途徑[12,13]。作為上游的調節分子，circRNA通過與miRNA競爭釋放下游分子而發揮作用。目前已發現circRNA參與腫瘤發生、增殖、凋亡和侵襲等過程，有望通過干預circRNA水平來達到治療腫瘤的目的。腫瘤細胞具有免疫原性，但腫瘤可以逃避免疫監視。實際上，在腫瘤發展的整個過程中，細胞必須克服內部和外部免疫的障礙才能成為腫瘤，只有癌細胞逃脫免疫監視并通過各種免疫逃逸機制克服免疫功能時，腫瘤才能進展或殺死宿主。現有報道指出，circRNA可以用作競爭性內源RNA來幫助腫瘤逃避免疫監視，且在免疫檢查點治療期間，circRNA表達的變化可能會影響治療的效果[14]，但具體機制尚不明確。

2 circRNA對各類腫瘤的作用

2.1 乳腺癌 Fang等[15]通過微陣列分析了人類乳腺癌和良性組織中circRNA的水平，發現circRNA circ-Ccnb1在癌癥樣品中被下調。Chen等[16]通過實驗表明，三陰性乳腺癌(TNBC)細胞系中的circEPSTI1(hsa_ circRNA_000479)水平上升，是TNBC患者生存的獨立預后指標。上述研究提示異常表達的circRNR有助于TNBC的早期診斷及預后判斷。此外，Chen等[16]研究還發現，circEPSTI1作為miRNA海綿，可與miR-4753和miR-6809結合，調節B細胞淋巴瘤/白血病11A基因表達，影響TNBC細胞增殖和凋亡。Gao等[17]研究發現，circ_0006528在TNBC組織和細胞系中過度表達，且與晚期腫瘤淋巴結轉移和預后不良密切相關。circ_0006528作為競爭性內源RNA，可通過miR-7-5p海綿作用并激活絲分裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號轉導通路來促進TNBC進展。表明circRNA可通過其miRNA海綿作用，影響TNBC相關靶基因的表達及其信號通路，參與TNBC的發生發展。

2.2 肺癌 Dai等[18]發現，circ0006916在惡性轉化細胞以及肺癌細胞和組織中下調，其通過與miR-522-3p結合并抑制PH結構域富含亮氨酸重復序列的蛋白磷酸酶1活性而成為肺癌的腫瘤抑制因子，通過減緩細胞周期進程來抑制細胞增殖。Zhu等[19]報道，hsa_circ_0013958在肺腺癌組織中明顯上調，同時被鑒定為miR-134的海綿，能夠上調癌基因細胞周期蛋白D1，在非小細胞肺癌(NSCLC)的發生發展中起著關鍵作用，與TNM分期和淋巴結轉移相關。表明circRNA可通過其miRNA海綿作用，參與肺癌的發生發展，并對肺癌的嚴重程度起預測作用。融合基因是由染色體異常易位引起的兩個分離基因的雜交。融合基因棘皮微管相關蛋白樣4(EML4)—間變性淋巴瘤激酶(ALK)存在于4%～5%的NSCLC病例中，并通過激活ALK產生致癌活性[20]。融合基因不僅編碼與腫瘤發生有關的融合蛋白，而且產生非編碼RNA，從而促進腫瘤的發展[20]。例如，混合譜系白血病(MLL)/AF9融合基因(f-circM9)產生的circRNA(F-circEA)就具有促增殖和促癌活性。值得注意的是，F-circEA主要存在于EML4-ALK陽性NSCLC患者血漿中,表明F-circEA可能是診斷EML4-ALK陽性NSCLC患者的潛在生物標志物。

2.3 結直腸癌 circRNR表達譜在結直腸癌細胞系和組織中有顯著的豐度變化，與結直腸癌的轉移、侵襲、預后等密切相關。Hsiao等[21]研究發現，circCCDC66在結直腸癌中表達升高，并與結直腸癌的不良預后有關。circCCDC66可通過與miR-33b、miR-93和miR-185結合來調節癌基因C-myc的表達。Zeng等[22]研究報道，circHIPK3在大腸癌組織和細胞系中顯著上調，并且與轉移和晚期臨床分期呈正相關。circHIPK3基因敲除可顯著抑制大腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲，并可誘導細胞凋亡，抑制大腸癌的生長和體內轉移。上調的circHIPK3可通過增加miR-7靶向原癌基因胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)、表皮生長因子受體(EGFR)、陰陽因子1(YY1)的表達，有效逆轉miR-7誘導的大腸癌細胞惡性表型的衰減。Li等[23]研究指出，circITGA7在大腸癌中具有腫瘤抑制作用，通過抑制Ras信號通路并促進ITGA7的轉錄來抑制大腸癌細胞的增殖和轉移。

2.4 食管癌 Wang等[24]研究發現，circ-TTC17在食管鱗狀細胞癌(ESCC)細胞和組織中明顯過表達，共有20個miRNAs(如miR-153、miR-217、miR-224和miR-370)和相應的靶mRNA與circ-TTC17發生相互作用,并且體外實驗表明，circ-TTC17促進了ESCC細胞的增殖和遷移。上調的circ-TTC17有可能成為將來ESCC診斷、治療和預后的新生物標記物。放療期間獲得的放射抵抗被認為是局部腫瘤復發或治療失敗的最重要原因。Su等[25]調查circRNA在食管癌放射抵抗中的作用，結果發現,與人類親代細胞系KYSE-150相比，人類抗輻射食管癌細胞系KYSE-150R中有57個circRNA顯著上調，而17個circRNA則下調，這些失調的circRNA可能參與了放射抗性的發展。隨后的circRNAmiR共表達網絡分析表明，circRNA_001059和circRNA_000167是潛在circRNA/miRNA網絡中最重要的因素。這些結果提示，異常表達的circRNA與食管癌細胞的抗輻射性有關。

2.5 其他腫瘤 circRNA不僅在實體腫瘤中發揮作用，而且可參與血液系統腫瘤發生發展。Guarnerio等[26]研究發現，在急性早幼粒細胞白血病細胞中，PML-RARa融合基因不僅可以翻譯融合蛋白，還可以形成circRNA f-circM9融合蛋白。功能增強測定和功能喪失測定表明，f-circM9發揮原癌基因作用，有助于急性早幼粒細胞白血病中的細胞轉化。另外，f-circRNA賦予了體內治療抗性，并與其他致癌因子(如融合蛋白)協同作用，從而促進癌癥的發展。2020年，Wu等[27]首次報道線粒體circRNA促癌功能研究，結果顯示mc-COX2是在慢性淋巴細胞白血病(CLL)血漿中高度表達的重要mt-circRNA(線粒體基因組衍生的circRNA)，且在CLL患者的血漿外泌體中高表達。其生物學和臨床特征也提示mc-COX2的上調與白血病的發生和CLL患者的生存率呈正相關；功能研究發現，通過沉默CLL細胞中的mc-COX2基因，可以增強抗腫瘤作用。這提示mt-circRNA在CLL中具有促癌作用，且在血漿中表達，為液體活檢方面提供了可能。雖然在血液系統腫瘤中circRNA報道較少，但已初步成為血液腫瘤領域研究熱點。

綜上所述，circRNA通過miRNA海綿作用、蛋白質結合分子、轉錄調節物、參與腫瘤逃逸及免疫等生物學功能參與腫瘤的發生發展，并與腫瘤預后轉歸有著密切關系。血漿和組織樣品中存在大量的circRNA，circRNA有望成為癌癥篩查及臨床診斷、治療和預后評估的生物標志物；未來circRNA在腫瘤早期篩查、腫瘤治療等領域具有巨大潛力。