艾司西酞普蘭體外對大鼠海馬神經干細胞存活和增殖的影響

王大力，曹金明，張君，孫耐，王文婷，顧平

1華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000；2河北醫科大學第一醫院

抑郁癥是一種常見的精神疾病，全球有超過3億人罹患抑郁癥，是世界范圍內的首要致殘原因。藥物治療是重型抑郁的主要治療措施，但臨床治愈率僅有30%～40%[1]。目前研究表明,抑郁癥患者常伴隨神經退行性變和神經發生減少[2]。神經干細胞(NSCs)能進行自我更新，并具有向神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞分化的潛能。當中樞神經系統受到各種生理、病理刺激時，NSCs將被激活，這對腦損傷和治療神經退行性疾病具有重要意義[3]。研究表明，壓力、糖皮質激素及抑郁癥時會影響腦內NSCs的增殖、分化，并對其造成損傷，進一步影響抑郁癥的治療及預后[4]。艾司西酞普蘭(ESC)是一種新型高選擇性的5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑(SSRIs)，通過抑制中樞神經系統5-HT的再攝取產生抗抑郁作用，但對去甲腎上腺素、多巴胺及細胞色素P450酶抑制作用小，所以安全性較其他SSRIs好，藥物相互作用少[5]。目前發現氟西汀、氟伏沙明及西酞普蘭等對NSCs具有促進存活及增殖的作用，但ESC對NSCs存活和增殖是否有影響少見報道。本研究觀察了ESC對新生大鼠海馬NSCs存活和增殖的影響，為臨床治療抑郁癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器及試劑 出生24 h內新生SD大鼠4只,購自河北醫科大學動物中心，合格證號SCXK(冀2018-004)。7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；二氧化碳培養箱(美國Napco公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；ESC原研藥(丹麥靈北制藥有限公司)；DMEM/F12(1∶1)培養液(美國Gibco公司)；堿性成纖維細胞生長因子(美國PeproTech公司)；B27 Supplement(美國Gibco公司)；雞抗巢蛋白(Nestin)抗體(美國Abcam公司)；RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；逆轉錄試劑盒(美國Promega公司)；MTS試劑盒(美國Promega公司)；山羊封閉血清(北京中杉金橋公司)；多聚賴氨酸(北京索萊寶公司)。

1.2 NSCs的體外分離、培養及鑒定 在無菌條件下，取上述4只SD大鼠兩側海馬，置于預冷的DMEM/F12培養液中；解剖顯微下剝離血管和腦膜，將分離出的海馬組織放入另一個預冷的DMEM/F12培養液中，緩慢輕柔吹打15～20次后成單細胞懸液；置于離心機中，1 000 r/min離心5min，棄上清，加入無血清的NSCs培養基(DMEM/F12+2%B27+20 ng/mL bFGF)重懸；細胞計數，以5×104/mL接種于25 cm2的培養瓶中，再置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，原代分離出的NSCs呈單細胞懸浮于培養基中。培養3 d需半量補液，發現3～5個細胞聚集呈球形或不規則形狀。培養7～10 d，神經球由15～20個細胞聚集。培養5～7 d后第1次傳代，收集神經球后胰酶消化成單細胞，計數后傳代，傳代比例約1∶2。選取第3代的NSCs用于實驗，其神經球呈規則圓形，體積明顯增大，折光性強，內部結構清晰。用干細胞標志物巢蛋白Nestin對第3代細胞進行染色，結果顯示神經球內大多數細胞呈Nestin染色陽性。

1.3 細胞分組及處理 實驗分為對照組和艾司西酞普蘭干預組(ESC組)。對照組：NSCs仍在無血清的NSCs培養基繼續培養；ESC組：NSCs中加入不同濃度ESC干預，培養液分別為DMEM/F12+2%B27+不同濃度(5、10、20、40 μmol/L)ESC。

1.4 大鼠海馬NSCs存活率測算及ESC最佳濃度篩選 采用MTS法。將消化后NSCs細胞懸液接種至96孔培養板，接種細胞個數為104個/孔，每孔100 μL培養液。分為對照組和5、10、20、40 μmol/L ESC組進行接種，每組5個復孔。培養5 d后，在每孔中加20 μL CellTiter 96?AQueous One SolutionReagent,避光，5% CO2、37 ℃溫箱中培養2 h后應用酶標儀在490 nm波長處檢測每孔的光密度值(OD值)，根據OD值計算出存活率。MTS檢測重復3次，取每組平均值進行統計學分析。對照組及5、10、20、40 μmol/L ESC組細胞存活率分別為(100.00+0.00)%、(107.56±0.38)%、(108.36±0.23)%、(166.69±0.30)%、(166.48±0.42)%，20、40 μmol/L ESC組細胞存活率較對照組增加(P均<0.05)，但20、40 μmol/L ESC組組間比較差異無統計學意義，提示20 μmol/L ESC最有益于NSCs的存活。

1.5 大鼠海馬NSCs細胞存活情況觀察 將對照組和20 μmol/L ESC組的NSCs消化成單細胞懸液，調整為105/mL接種至12孔板中，加入0.4%的臺盼藍混勻后進行染色。在染色3 min內計數活細胞及死細胞數目，鏡下觀察見活細胞不染色，死細胞染成淡藍色，隨機觀察3個視野，計算活細胞率。用活細胞率來表示細胞活力，連續計數5 d，觀察細胞存活情況。

1.6 大鼠海馬NSCs細胞活力檢測 通過記錄每天對照組和20 μmol/L ESC組細胞數目來評價細胞活力。將兩組生長良好接近匯合的細胞，消化吹打成單細胞懸液并調至為1×105/mL接種于12孔板，每組共接種15孔，每24 h計數1次細胞，每組每次分別計數3個孔，計算平均值，連續計數5 d，繪制兩組NSCs的生長曲線。

1.7 大鼠海馬NSCs Nestin陽性細胞球檢測 將對照組、20 μmol/L ESC組的NSCs培養5 d后，以1×105個/孔分別接種到提前包被多聚賴氨酸的24孔板里培養，6～8 h NSCs貼壁，進行免疫熒光染色，實驗重復3次。將各組細胞，用0.01 mol/L PBS緩沖液洗5 min，洗3次；再加入4%多聚甲醛室溫固定15 min；0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，5 min/次；然后山羊血清37 ℃孵育40 min；加入Nestin一抗(1∶100)，4 ℃過夜；0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，5 min/次，加入熒光二抗山羊抗雞FITC(1∶100)，37 ℃避光孵育30 min；0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，5 min/次；Hoechst染核3～5 min；再用0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，5 min/次，封片。熒光顯微鏡觀察。每個孔隨機觀察5個非重疊視野。用平均每個視野的Nestin陽性細胞球比較兩組增殖情況。

1.8 大鼠海馬NSCs Nestin mRNA表達檢測 采用RT-PCR技術。各取對照組、20 μmol/L ESC組5×106個細胞，提取總RNA，嚴格按試劑盒說明操作；反轉錄成cDNA，反應體系為20 μL，包含4 μL 5×miScritHiSpec溶液、2 μL 10×miScritNucleics混合液、2 μL miScript反轉錄混合液、2 μL無RNA酶水和10 μL模板RNA。以β-actin為內參，利用ABI 7500 PCR儀進行RT-PCR擴增反應。每組3個復孔，實驗重復3次。反應條件：95 ℃變性15 min，94 ℃變性15 s、58 ℃退火30 s、70 ℃延伸30 s，重復32次循環。β-actin上游引物序列：5′-CCGCGAGTACAACCTTCTTG-3′，下游引物序列：5′-TGACCCATACCCACCATCAC-3′；Nestin上游引物序列：5′-GGGGGTAGGAGATGCCTTTG-3′，下游引物序列：5′-CCTTTAGAGCACCCACCTCC-3′。實驗結果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

2 結果

2.1 ESC對大鼠海馬NSCs存活情況的影響 臺盼藍染色計數對照組及20 μmol/L ESC組的活/死細胞數目，可見兩組細胞存活率均在99%以上，對照組1～5 d的存活率分別為(99.23±0.44)%、(99.17±0.45)%、(99.24±0.07)%、(99.11±0.57)%、(99.24±0.19)%，ESC組分別為(99.30±0.05)%、(99.31±0.21)%、(99.26±0.16)%、(99.13±0.08)%、(99.18±0.27)%，兩組比較差異無統計學意義。

2.2 ESC對大鼠海馬NSCs增殖的影響 對照組1～5 d細胞個數分別為(1.00±0.00)×105、(1.15±0.02)×105、(1.25±0.03)×105、(1.52±0.02)×105、(2.06±0.02)×105個，20 μmol/L ESC組分別為(1.00±0.00)×105、(1.24±0.09)×105、(1.76±0.01)×105、(2.49±0.02)×105、(3.52±0.06)×105個。兩組NSCs的生長均呈持續增長趨勢，在傳代的1～2 d，細胞增殖速度平緩，培養3～5 d時，細胞增殖速度明顯加快，且ESC組的細胞數目及斜率高于對照組，說明ESC能促進NSCs的增殖(P<0.05)。

對照組、20 μmol/L ESC組Nestin陽性神經球個數分別為(18.33±1.25)、(35.00±0.82)個，兩組比較P<0.05。

2.3 ESC對大鼠海馬NSCs Nestin mRNA表達的影響 對照組、20 μmol/L ESC組Nestin mRNA相對表達量分別為1.00±0.03、6.23±0.16，兩組比較P<0.05。

3 討論

抑郁癥又稱抑郁障礙，以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，是世界首位的致殘疾病，其危害程度遠超心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等疾病。國際抑郁癥流行病學大數據調研顯示，其終生患病率為8%～12%，而且呈逐年上升趨勢。近年來研究發現，抑郁癥患者存在腦容量減少、腦室擴大、神經元凋亡及部分腦皮質及邊緣系統的神經膠質細胞減少等現象，提示抑郁癥存在神經退行性改變[6]。目前認為，發育中及成年哺乳動物中室管膜、海馬齒狀回顆粒細胞層下區、嗅球及皮質等區域存在具有自我更新和分化潛能的NSCs，且在一定因素的影響下，NSCs可以大量增殖并持續數周[7]。然而，無論是嚙齒類動物還是人類,在壓力、糖皮質激素及應激的刺激下，腦內NSCs增殖能力下降，嚴重時將對其造成損傷[4]，主要表現為海馬等部位萎縮和神經元數量減少，并伴有樹突、突觸的重塑及膠質細胞的改變等[6]。近年來，科學家們發現抗抑郁藥則很有可能通過誘導海馬新生神經元的產生，促進成年大腦邊緣皮層正常功能的恢復而發揮臨床療效。那么，抑郁藥是否直接調控NSCs的增殖及其作用機制均為研究重點[8]。本研究利用體外培養環境單一、條件易控的優勢，以新生SD大鼠海馬來源的NSCs作為細胞模型；穩定傳至第3代，免疫熒光染色顯示NSCs神經球Nestin表達強陽性，證明成功完成NSCs的體外原代分離、培養與鑒定，能為后續試驗的順利開展奠定基礎。

研究報道，有些SSRI類抗抑郁藥物可以逆轉抑郁癥導致的海馬神經增生受損，具有促進NSCs增殖及神經發生的作用。例如，100 pmol/L～1 μmol/L的氟西汀能促進海馬NSCs增殖并存在劑量依賴效應[9，10]；1 nmol/L氟伏沙明能顯著提高體外培養NSCs的存活率[11]；帕羅西汀通過ERK1/2信號通路介導不僅提高NSCs增殖能力，還促進NSCs向膠質細胞以外的神經元分化[12]；舍曲林雖對NSCs增殖無影響，但能保護NSCs免受脂多糖誘導的細胞損傷，具有促進神經發生和保護NSCs的作用[13]；西酞普蘭能逆轉抑郁癥模型中海馬神經發生的改變，這種改變與行為改善的時間過程相似，其與褪黑素聯合應用降低了海馬齒狀回血漿皮質酮水平，增加了細胞增殖、存活率和相關新神經元的絕對數量[14]。此外，西酞普蘭可通過增加NSCs增殖和存活率從而促進成人骨髓間充質干細胞的神經元分化，增強骨髓間充質干細胞的神經元特性[15]。1.0 μmol/L和0.5 μmol/L西酞普蘭干預7 d，能顯著促進胚胎大鼠海馬神經前體細胞增殖與分化。ESC是一新型的SSRIs，與其他SSRIs不同的是，ESC減少了西酞普蘭右旋異構體對左旋異構體與突觸前膜結合位點的干擾，進一步增加了5-HT的釋放，繼而通過5-HT的受體促進海馬內神經發生的恢復，從而達到高效抗抑郁焦慮的作用。5-HT被認為是調節成年海馬神經發生的物質，外源性5-HT還可挽救成人體內NSCs增殖[16]。研究表明，在重度抑郁老鼠模型中，給予ESC治療后大鼠海馬5-HT表達增加，抑郁樣行為顯著減少[17]。隨著年齡的增長，5-HT能神經傳遞的減少會增加老年人群患抑郁癥等神經精神疾病的風險，然而經ESC治療的大腦較正常衰老的大腦轉錄發生、顆粒細胞增殖、血管收縮相關基因及激素反應相關基因增加，促進了神經功能恢復，對神經細胞存活、增殖具有重要作用[18]。腦卒中后抑郁大鼠的海馬NSCs增殖減少，給予ESC治療3周后發現此大鼠海馬齒狀回NSCs增殖顯著提高[19]。ESC對慢性低灌注大鼠的缺血區細胞增殖具有促進作用，增加了突觸結合蛋白及突觸小泡蛋白含量，并對三維血管分布、細胞形態及血漿血管內皮生長因子具有正性調控作用，可改善神經發生的微環境，對神經系統的完善起重要作用[20]。本研究實驗結果顯示，20 μmol/L的ESC對NSCs具有較好的促存活作用；生長曲線顯示ESC組細胞數目顯著高于對照組，增殖速率也明顯高于對照組，提示20 μmol/L的ESC有促進NSCs增殖的作用；進一步免疫熒光染色和RT-PCR結果顯示，20 μmol/L的ESC促進NSCs表達Nestin，表明一定濃度的ESC具有促進體外培養NSCs存活和增殖的作用。

綜上所述，20 μmol/L的ESC可正性調控新生大鼠海馬NSCs的存活和增殖。在后續的研究工作中，將深入探討ESC促進NSCs增殖和存活的分子機制及其能否促進NSCs向神經元方向分化等問題。