口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中TM4SF1 mRNA的篩選及其蛋白的表達(dá)變化觀察

劉佳藝，邵夢(mèng)楠，檀燕君，鄭盛峰1,，楊小麗，李萍

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；3廣西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心

口腔鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)約占口腔面部惡性腫瘤的80%以上，是最常見的一種口腔癌病理類型，其病死率約占世界癌癥病死率的第 6 位[1]，具有很高的轉(zhuǎn)移潛能[2],延遲治療被認(rèn)為是存活率無(wú)改善的主要原因。因此，尋找能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生以及監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的分子靶點(diǎn)具有重要意義。跨膜四超家族成員1蛋白(TM4SF1)是一種在多數(shù)上皮細(xì)胞癌中高表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，并具有抗體介導(dǎo)治療的潛在靶點(diǎn)[3]。研究表明，TM4SF1對(duì)前列腺癌[4]、肺癌[5]、乳腺癌[6]、肝癌[7]特別是胰腺癌[8]等多種癌細(xì)胞的增殖、黏附、運(yùn)動(dòng)和侵襲有調(diào)節(jié)作用。然而，TM4SF1在口腔鱗癌中的作用尚未闡明。2019年5～10月，本研究結(jié)合高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO，https://www.Ncbi.nlm.nih.gov/gds)和免疫組化方法觀察了TM4SF1在口腔鱗癌患者的癌組織和癌旁黏膜組織中的表達(dá)變化,并分析其與臨床病理資料的關(guān)系，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年1月～2019年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院接受手術(shù)治療的口腔鱗癌患者41例，年齡30～ 88歲，發(fā)病部位在舌體21例、唇部 6例、牙齦6例、頰部4例、腭部2例、扁桃體腺窩及頜下區(qū)分別為1例。按American Joint Committee on Cancer(AJCC，2016年第八版)分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期5例、Ⅱ期9例、Ⅲ期8例、Ⅳ期10例。手術(shù)前，患者均未采取放、化療等措施，術(shù)中留取腫瘤組織及癌旁黏膜組織(距離腫瘤組織>3 cm或無(wú)癌組織浸潤(rùn)的手術(shù)切緣)，組織離體后立即用4%中性甲醛緩沖液固定。在采集標(biāo)本前，均取得患者及其家屬同意并簽署相關(guān)知情同意書，后經(jīng)廣西口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 口腔鱗癌和癌旁黏膜組織中TM4SF1 mRNA的篩選及分析 從GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.Ncbi.nlm.nih.gov /gds)下載口腔鱗癌基因表達(dá)譜及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)(研究號(hào)分別為GSE13601、GSE19089、GSE74530、GSE78060、GSE9844)。GSE13601 包含1個(gè)芯片平臺(tái)，為 Affymetrix Human Genome U95 Version 2 Array(GPL8300)；GSE19089含1個(gè)芯片平臺(tái)，為Illumina HumanHT-12 V3.0 expression beadchip(GPL6947)；GSE74530含1個(gè)芯片平臺(tái)，為Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array(GPL570)；GSE78060含1個(gè)芯片平臺(tái)，為Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array(GPL570)；GSE9844含1個(gè)芯片平臺(tái)，為Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array(GPL570)。從這5個(gè)TM4SF1探針中獲得標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(SMD)和中間表達(dá)值。利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的GEO2R工具對(duì)口腔鱗癌和癌旁黏膜組織中TM4SF1 mRNA進(jìn)行篩選和分析。用Stata軟件將提取的芯片信息組合在一起，5個(gè)基因表達(dá)矩陣生成森林圖。

1.3 口腔鱗癌及癌旁組織中TM4SF1蛋白檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)SP法。口腔鱗癌及癌旁黏膜組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后，用4 μm厚度連續(xù)切片，采用0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)5 min；室溫自然冷卻，加入SP-9000試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)中的內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑反應(yīng)15 min；PBS沖洗3次，加入封閉用正常山羊血清工作液15 min；傾倒后分別加入兔抗人多克隆TM4SF1抗體(1∶200，ab113504，購(gòu)自Abcam公司)，4 ℃恒溫冰箱孵育過(guò)夜；PBS沖洗3次，加山羊抗小鼠/兔IgG聚合物反應(yīng)15 min，PBS沖洗3次；加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液15 min，PBS沖洗3次；利用DAB顯色試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色后蘇木素復(fù)染。最后所有切片在顯微鏡下進(jìn)行雙盲免疫反應(yīng)性評(píng)分系統(tǒng)(IRS)評(píng)分。IRS是由細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞染色比例的數(shù)據(jù)結(jié)合而成，染色強(qiáng)度分為0～3級(jí)：細(xì)胞不著色計(jì)0分；弱染色(淡黃色)計(jì)1分；中度染色(中黃色)計(jì)2 分；強(qiáng)烈染色(棕黃色)計(jì)3 分。細(xì)胞染色的比例按0～4等級(jí)評(píng)分如下：染色細(xì)胞<1%計(jì)0分；1%～10%計(jì)1分；11%～50%計(jì)2分；51%～80%計(jì)3分；>80%計(jì)4分。最終IRS為染色得分乘以染色比例，總得分大于3為陽(yáng)性表達(dá)，總分1～3為低表達(dá)，0為陰性表達(dá)[9]。

2 結(jié)果

2.1 口腔鱗癌組織中TM4SF1 mRNA的篩選、分析結(jié)果 GSE13601、GSE19089、GSE74530、GSE78060、GSE9844基因表達(dá)矩陣分析結(jié)果顯示，口腔鱗癌組織中TM4SF1 mRNA表達(dá)高于癌旁組織(P均<0.05)。森林圖顯示，口腔鱗癌組織中TM4SF1 mRNA表達(dá)高于癌旁組織(SMD=1.520；I2=81.3%；95%CI：0.507～0.958；P<0.05)。

2.2 口腔鱗癌組織及癌旁黏膜組織TM4SF1蛋白、mRNA表達(dá)比較 TM4SF1蛋白在口腔鱗癌癌細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞膜，呈連續(xù)性表達(dá)，部分呈棕黃色細(xì)顆粒狀出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)；癌旁黏膜組織中TM4SF1蛋白表達(dá)主要呈陰性或低表達(dá)。口腔鱗癌組織及癌旁黏膜組織中TM4SF1蛋白高表達(dá)分別為22、17例，低表達(dá)或陰性表達(dá)分別為19、24例，兩者比較，P<0.05。口腔鱗癌組織和癌旁黏膜組織的IRS評(píng)分分別為4.20、2.44分，兩者比較，P<0.05。

2.3 口腔鱗癌組織中TM4SF1蛋白表達(dá)與患者臨床病理資料的關(guān)系 TM4SF1蛋白在Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，但其他臨床病理參數(shù)包括民族、年齡、性別、吸煙、飲酒、血型、分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TM4SF1蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

3 討論

TM4SF1是跨膜4蛋白16超家族的成員，由202個(gè)氨基酸組成的低分子量蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量約為21 kD[10,11]。在染色體區(qū)TM4SF1基因定位于3q21-3q25，在質(zhì)膜和胞內(nèi)小泡中大量表達(dá)。在活化的內(nèi)皮細(xì)胞中TM4SF1蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)，可激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-A或凝血酶來(lái)刺激血管生成，通過(guò)增加絲狀偽足的形成，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

TM4SF1也稱腫瘤相關(guān)抗原L6(TAAL6)，是TM4SF家族的一個(gè)遠(yuǎn)親。Gordon 等[12]認(rèn)為 TM4SF1可促進(jìn)胸膜間皮腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和肺癌細(xì)胞的侵襲能力，抗體(Anti-TM4SF1)可以使肺癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低[13]。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，TM4SF1基因的低表達(dá)、不表達(dá)可明顯減弱宮頸癌細(xì)胞和前列腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。Shih等發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)中TM4SF1蛋白呈高表達(dá)，并與EC 的偽足形成密切相關(guān)，將TM4SF1基因沉默后可有效阻止EC的偽足形成、抑制EC的遷移，可大量抑制VEGF-A誘導(dǎo)的微血管形成。Gordon等[12]報(bào)道，TM4SF1是惡性胸膜間皮瘤細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展被證實(shí)與TM4SF1有關(guān)，然而TM4SF1在口腔鱗癌中的表達(dá)情況目前尚未見報(bào)道。

本研究首先通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌組織中TM4SF1的mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。進(jìn)一步通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TM4SF1蛋白在口腔鱗癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁黏膜組織，提示TM4SF1可作為口腔鱗癌潛在診斷標(biāo)志物。Gao等[14]發(fā)現(xiàn)，TM4SF1蛋白在FIGO Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮性癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于FIGOⅠ～Ⅱ期。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ～Ⅳ期口腔鱗癌患者癌組織中TM4SF1蛋白表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期口腔鱗癌，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似，提示TM4SF1的表達(dá)隨著口腔黏膜上皮細(xì)胞的異常增生和惡性轉(zhuǎn)化而升高，因此認(rèn)為，TM4SF1可能參與了口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。研究[4]表明，TM4SF1對(duì)癌細(xì)胞的部分生物行為有重要影響，包括癌細(xì)胞的分化程度、轉(zhuǎn)移能力和生長(zhǎng)情況,但本研究并未發(fā)現(xiàn)TM4SF1與口腔鱗癌分化程度、轉(zhuǎn)移能力和腫瘤大小有關(guān)，可能與本研究病例數(shù)偏少及入選病例中壯族人口占比較多有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，TM4SF1 mRNA及蛋白在口腔鱗癌中的表達(dá)水平高于癌旁黏膜組織，并與口腔鱗癌高臨床分期有關(guān)，表明TM4SF1可能參與了口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展，但其確切機(jī)制目前尚不清楚，進(jìn)一步擬設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探究TM4SF1參與口腔鱗癌進(jìn)展的機(jī)制。