不同病理類型狼瘡性腎炎患者腎小球IgG亞型沉積特點(diǎn)及意義

萬慧婷,吳琳,趙秀芬,錢軍,袁楊剛,邢昌贏

江蘇省人民醫(yī)院，南京210029

IgG類自身抗體具有高親和力，參與細(xì)胞清除、細(xì)胞受體效應(yīng)等，往往反映病理過程。多數(shù)參與自身免疫病的自身抗體是IgG型。自身抗體與游離分子反應(yīng)形成病理性抗原一抗體免疫復(fù)合物，通過激活補(bǔ)體產(chǎn)生炎癥。根據(jù)IgG分子重鏈恒定區(qū)的不同可將其分成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四種亞型，它們具有不同的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特點(diǎn)[1]。IgG4亞型測(cè)定在病因鑒別、疾病特點(diǎn)分析及轉(zhuǎn)歸中有重要價(jià)值。在不同的腎臟病中，腎組織沉積的IgG亞型不盡相同。根據(jù)IgG亞型腎小球免疫熒光強(qiáng)度評(píng)分及血清IgG抗體濃度測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在狼瘡性腎炎(LN)中，IgG1、IgG2、IgG3均有沉積[2]，然而在不同病理類型的LN中IgG亞型在腎小球的沉積特點(diǎn)研究較少。本研究擬分析不同病理類型的LN中IgG亞型在腎小球的沉積特點(diǎn)并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年5月～2016年10月于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科或風(fēng)濕免疫科住院的SLE患者，其診斷符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)1997年制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)腎活檢病理診斷為L(zhǎng)N，排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腫瘤；②合并嚴(yán)重感染。入選病例共61例，男10例、女51例，年齡17～66(35.8±13.3)歲。按照 WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腎小球病變的病理分型[3]，Ⅱ型4例，Ⅲ型6例，Ⅳ型23例，Ⅴ型28例。24小時(shí)尿蛋白為2.6(1.3,4.6)g，血清白蛋白(25.7±7.6)g/L，血清肌酐68.9(52.9,109.5)μmol/L，血清尿素(8.19±5.12)mmol/L，肌酐清除率(Ccr)為(104.98±68.33) mL/min，腎小球?yàn)V過率(eGFR)為(91.03±38.18)mL/min·1.73 m2，血清IgG為11.5(7.7,15.9)g/L，血清C3為0.46(0.31,0.69)g/L，血清C4為0.07(0.064,0.12)g/L。

1.2 IgG亞型的測(cè)定 采用常規(guī)直接免疫熒光法進(jìn)行抗體染色。FITC標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體IgG1(ab99772)、IgG2(ab99788)、IgG3(ab99827)、IgG4(ab99821)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。冰凍切片吹干，冷丙酮固定，PBS洗滌，10% BSA封閉30 min，PBS 洗滌，滴加抗體，小鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4均以1∶150稀釋，37 ℃孵育1 h。PBS沖洗，吹干，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。半定量記錄熒光強(qiáng)度，由陰性到最強(qiáng)，計(jì)為0～++++，陰性的陽性強(qiáng)度計(jì)為0；低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下明顯可見為+，陽性強(qiáng)度計(jì)為1；低倍鏡下明顯可見，高倍鏡下清晰可見為++，陽性強(qiáng)度計(jì)為2；低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼為+++，陽性強(qiáng)度計(jì)為3；低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼計(jì)++++，陽性強(qiáng)度計(jì)為4，計(jì)算陽性強(qiáng)度平均值。

2 結(jié)果

2.1 IgG亞型的免疫熒光染色結(jié)果 83.6%的病例IgG1、IgG2、IgG3均有陽性染色，且陽性相對(duì)較強(qiáng)，沉積部位主要在腎小球基底膜上皮下，少量在系膜區(qū)和腎小管上皮有沉積。IgG4較前三個(gè)亞型沉積少，且程度較弱。61例LN患者中IgG1陽性表達(dá)54例，陽性率88.5%，IgG2陽性表達(dá)56例，陽性率91.8%，IgG3陽性表達(dá)53例，陽性率86.8%，IgG4陽性表達(dá)25例，陽性率40.9%。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4陽性強(qiáng)度分別為2.06、2.09、2.36、0.65。IgG1、IgG2、IgG3的陽性率及陽性強(qiáng)度間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IgG1、IgG2、IgG3與IgG4的陽性率、陽性強(qiáng)度比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。Ⅱ型4例，其中IgG1、2、3、4的陽性率分別為75.0%、75.0%、75.0%、25.0%；陽性強(qiáng)度分別為1.50、1.50、2.00、0.25。Ⅲ型6例，其中IgG1、2、3、4的陽性率分別為50.0%、50.0%、50.0%、0%；陽性強(qiáng)度分別為1.17、1.00、1.50、0。Ⅳ型23例，其中IgG1、2、3、4的陽性率分別為100.0%、100.0%、95.6%、47.8%；陽性強(qiáng)度分別為2.43、2.43、2.74、0.78。Ⅳ型23例，其中IgG1、2、3、4的陽性率分別為100.0%、100.0%、95.6%、47.8%；陽性強(qiáng)度分別為2.43、2.43、2.74、0.78。Ⅴ型28例，其中IgG1、2、3、4的陽性率分別為89.2%、96.4%、85.7%、46.4%；陽性強(qiáng)度分別為2.03、2.14、2.21、0.79。由于Ⅱ型和Ⅲ型樣本量太少，將兩者合并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果IgG1、IgG2、IgG3在各病理類型間的分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Ⅳ型/Ⅴ型的IgG4陽性率大于Ⅱ型和Ⅲ型(P<0.01),而Ⅳ型和Ⅴ型間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 各IgG亞型與病理指標(biāo)強(qiáng)度間的關(guān)系 IgG1與IgG、C1q呈正相關(guān)(ρ分別為0.271、0.272,P均<0.05)；IgG2與C1q呈正相關(guān)(ρ=0.276,P=0.031)；IgG3與C1q、C3呈正相關(guān)(ρ分別為0.540、0353,P均<0.05)。IgG4與各病理指標(biāo)間均無相關(guān)性(P均>0.05)。

2.3 IgG亞型與疾病活動(dòng)度的關(guān)系 IgG1與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)(ρ=0.351,P=0.006)，與血清C3、C4呈負(fù)相關(guān)(ρ分別為-0.330、-0.365,P均<0.05)；IgG2與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)(ρ=0.395,P=0.002)，與血清C3、C4呈負(fù)相關(guān)(ρ分別為-0.382、-0.343,P均<0.05)；IgG3與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)(ρ=0.273,P=0.033)，與血清C3、C4呈負(fù)相關(guān)(ρ分別為-0.542、-0.495,P均<0.05)；IgG4與eGFR呈負(fù)相關(guān)(ρ=0.258,P=0.048)。

2.4 IgG亞型間的相互關(guān)系 IgG1與IgG2、IgG3呈正相關(guān)(ρ分別為0.679、0.557,P均<0.001)，IgG2與IgG3(ρ=0.506,P<0.001)呈正相關(guān)，IgG4與其他三種亞型間均無相關(guān)性(P均>0.05)。

3 討論

IgG是人體血清免疫球蛋白的主要成分，分為 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 4個(gè)亞類，它們具有高度的同源性，又有不同的理化特性，參與免疫反應(yīng)的途徑及生物學(xué)活性各不相同，在多種疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。IgG四種亞型各自不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了它們不同的生物學(xué)活性。如IgG1、IgG2和IgG3與抗原形成免疫復(fù)合物通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，而IgG4則發(fā)生聚合通過替代途徑激活補(bǔ)體。在IgG介導(dǎo)的自身免疫病中，主要是IgG1和IgG3型自身抗體占優(yōu)勢(shì)，廣泛參與疾病的免疫病理過程。但實(shí)際上，對(duì)于大多抗原的免疫應(yīng)答均有4種亞型的共同參與，在諸多自身免疫病中可發(fā)現(xiàn)IgG4型自身抗體。至于它們?nèi)绾螀f(xié)同發(fā)揮免疫作用目前尚不清楚。

IgG亞型在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用越來越引起研究者的重視。SLE是最常見的自身免疫性疾病，表現(xiàn)為產(chǎn)生多種自身抗體以及多臟器受累，其中LN是SLE最常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥。對(duì)SLE患者血清自身抗體的IgG亞型研究中發(fā)現(xiàn)，IgG1、IgG2、IgG3型主要參與了SLE的病理機(jī)制[4]。在對(duì)狼瘡腎病的研究中，多數(shù)研究者認(rèn)為IgG1、IgG2、IgG3在腎小球中均有沉積，而IgG4無沉積或強(qiáng)度不如前3者[5,6]。最近一項(xiàng)大規(guī)模的IgG 亞型研究包含了307例LN，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型均表現(xiàn)出以IgG1、IgG2、IgG3陽性為主，IgG4沉積很少且熒光強(qiáng)度低的表型，IgG亞型的分布在Ⅰ/Ⅱ系膜型與Ⅲ/Ⅳ增殖型之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于Ⅴ型LN，IgG1、IgG2、IgG3的表達(dá)同樣豐富，同時(shí)IgG4的表達(dá)明顯多于前幾種病理類型[7]。國(guó)內(nèi)研究者在腎小球IgG亞型分布方面主要比較特發(fā)性膜性腎病及繼發(fā)性膜性腎病中4種IgG亞型的分布。其中在狼瘡膜性腎病中，IgG1、IgG3、IgG4三種亞型均有沉積(IgG2未做)，IgG4較少沉積且強(qiáng)度顯著低于其他亞型，結(jié)果與國(guó)外一致[8]。但在另一項(xiàng)研究中，狼瘡膜性腎病中IgG亞型的分布與前述不同，IgG1的陽性率僅為22.5%，IgG2和IgG3陽性率較高，分別為67.5%和57.5%，IgG4則顯著不同，40例標(biāo)本均為陰性[9]。

本研究通過對(duì)LN的腎活檢樣本行IgG亞型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IgG1、IgG2、IgG3均有大量沉積，其中IgG1陽性率88.5%，IgG2陽性率91.8%，IgG3陽性率86.8%，三者熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但陽性強(qiáng)度相互之間均呈線性相關(guān)。IgG4陽性率最低，為40.9%，均伴有其他亞型抗體同時(shí)沉積，未見IgG4單獨(dú)沉積，其強(qiáng)度與其他三種亞型無相關(guān)性。由此可見，在IgG介導(dǎo)的腎損害中IgG1、IgG2、IgG3可能發(fā)揮主要作用，且存在協(xié)同效應(yīng)共同介導(dǎo)LN的發(fā)病，而IgG4陽性率及強(qiáng)度低于其他亞型且與其他亞型之間無相關(guān)性，提示IgG4與其他幾種IgG亞型的免疫途徑不同，可能是以單獨(dú)途徑參與免疫反應(yīng)的。對(duì)于不同病理類型的IgG亞型分布特點(diǎn)，可觀察到Ⅳ型及Ⅴ型的IgG4表達(dá)明顯高于Ⅱ型和Ⅲ型，IgG1、IgG2、IgG3型的表達(dá)與總體特征一致。

不同的IgG亞型其物理化學(xué)性質(zhì)及免疫機(jī)制各不相同，如補(bǔ)體結(jié)合能力，所以在免疫復(fù)合物沉積在腎組織后所引起的損傷也是不同的。我們對(duì)各個(gè)IgG亞型與病理指標(biāo)及臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，IgG1、IgG2、IgG3均與C1q呈正相關(guān)，表明這三個(gè)亞型均能激活補(bǔ)體，C3僅與IgG3呈正相關(guān)，可能與IgG3的分子結(jié)構(gòu)相關(guān)。由于其鉸鏈區(qū)有62個(gè)氨基酸，分子柔性最大，故能最有效地激活補(bǔ)體[10]。另IgG3與C1q的相關(guān)系數(shù)比與C3的相關(guān)系數(shù)更大，表明IgG對(duì)LN的腎組織損傷主要激活經(jīng)典途徑，且亞型以IgG3為主。臨床指標(biāo)方面，IgG1、IgG2、IgG3均與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)，與血清C3和C4呈負(fù)相關(guān)，其中以IgG3與血清C3和C4的相關(guān)系數(shù)最大，分別為-0.542和-0.495，這一結(jié)果表明IgG1、IgG2、IgG3三個(gè)亞型均與LN的活動(dòng)性有關(guān)，且以IgG3最為相關(guān)，與前述IgG3分子能最有效激活補(bǔ)體的能力一致。另外，IgG4與eGFR呈負(fù)相關(guān)，說明IgG4的沉積對(duì)腎小球的濾過功能造成了不利影響。

綜上所述，四種IgG亞型在LN患者腎小球中均有沉積，IgG1、IgG2、IgG3呈強(qiáng)分布，IgG4陽性率及熒光強(qiáng)度比前三者少。IgG1、IgG2、IgG3三者呈正相關(guān)且均與LN活動(dòng)性相關(guān)指標(biāo)有一定關(guān)系，與IgG4無相關(guān)性；LN的致病機(jī)制可能經(jīng)IgG1、IgG2、IgG3聯(lián)合途徑及IgG4獨(dú)立途徑的免疫反應(yīng)參與。但由于樣本量較小，且未測(cè)定患者血清中IgG亞型的濃度，本研究有一定局限性，今后可擴(kuò)大樣本量，通過對(duì)患者隨訪觀察，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者血清IgG亞型水平，進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同IgG亞型沉積對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸及遠(yuǎn)期預(yù)后的臨床意義。