植物同源域指2在卵巢癌中的表達(dá)及對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

王 佳，楊 蕾，劉 菲

根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2019年卵巢癌的新發(fā)病率占女性腫瘤的3%，其病死率排名第5[1]。盡管近幾十年來(lái)生活水平和卵巢癌治療技術(shù)在不斷提高，但是卵巢癌患者的總生存率并未顯著改善[2]。導(dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后不良的主要因素之一是轉(zhuǎn)移率較高，而目前卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未明確[3]。植物同源域指2(plant homeodomain finger 2, PHF2)是一種二甲基化的組蛋白H3賴氨酸9(H3K9me2)脫甲基酶，在肝細(xì)胞的糖異生、體外巨噬細(xì)胞免疫及同源性的信號(hào)傳遞和脂肪形成中發(fā)揮重要作用[4]。相關(guān)研究報(bào)道，PHF2在急性淋巴細(xì)胞白血病和腎透明細(xì)胞癌等多種腫瘤中低表達(dá)，并與腫瘤的臨床病理參數(shù)相關(guān)[5-6]，但是PHF2在卵巢癌中的表達(dá)及作用未知。在肝細(xì)胞肝癌中PHF2的較低表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移，并與患者的整體生存期較差相關(guān)[7]。目前PHF2與卵巢癌的轉(zhuǎn)移是否存在相關(guān)性引起研究人員的關(guān)注。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)EMT獲得周圍侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要作用機(jī)制[8]。因此本文通過(guò)研究PHF2在卵巢癌中的表達(dá)意義，以及在卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用和對(duì)EMT的影響，旨在獲得PHF2作為治療卵巢癌新靶點(diǎn)的重要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2015年1月—2019年12月入住我院首次行手術(shù)治療的原發(fā)性卵巢癌患者，收集術(shù)前未經(jīng)放化療、免疫治療等任何形式抗腫瘤治療的卵巢癌組織標(biāo)本80例，其中患者年齡32～70(48.78±15.64)歲；>50歲者42例，≤50歲者38例；漿液性癌49例，黏液腺癌31例；分化程度：中高分化64例，低分化16例；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期21例，Ⅲ期24例，Ⅳ期6例；有脈管侵犯45例，無(wú)脈管侵犯35例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。另納入同時(shí)期因良性疾病手術(shù)獲得的正常卵巢組織30例，患者年齡41～73(49.98±13.04)歲，與腫瘤患者臨床資料具有可比性。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究由醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 載玻片和非免疫羊血清購(gòu)自中國(guó)福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；二甲苯和乙醇購(gòu)自中國(guó)深圳中粵化學(xué)有限公司；枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液和加拿大中性樹(shù)膠購(gòu)自中國(guó)北京Solarbio試劑公司；DAB試劑盒購(gòu)自丹麥DAKO試劑公司；PHF2、上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)抗體購(gòu)自美國(guó)proteintech公司；卵巢癌細(xì)胞系CP70、CoC1和CAOV-4及人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；細(xì)胞培養(yǎng)基、FBS和胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；強(qiáng)效蛋白裂解液和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自中國(guó)大連Meilunbio?公司；PHF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coring公司。

1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè) 卵巢癌組織和正常卵巢組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，及梯度濃度乙醇水化，枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液(0.01 mol/L，pH值6.0)中高壓煮沸3 min，3%過(guò)氧化氫甲醇溶液中避光室溫孵育30 min，滴加非免疫羊血清室溫封閉1 h。滴加PHF2一抗(稀釋比為1∶100)，PBS代替PHF2一抗作為陰性對(duì)照，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌5 min，3次。滴加DAB試劑盒中的二抗，37℃孵育30 min，PBS洗滌5 min，3次。DAB顯色(陽(yáng)性為黃色)，蘇木素染核，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，干燥，封片。在低倍顯微鏡下觀察染色強(qiáng)度和染色面積，并評(píng)分。染色強(qiáng)度：無(wú)黃色為0分，淺棕黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分；染色面積<5%為0分，5%～25%為1分；26%～50%為2分；51～75%為3分；≥76%為4分。染色強(qiáng)度和染色面積二者之和>3分為陽(yáng)性表達(dá)，≤3分為陰性表達(dá)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞系CP70、CoC1和CAOV-4及人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80快速?gòu)?fù)蘇后重懸于含有10% FBS的培養(yǎng)基中，放置培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基顏色變化時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，PBS洗滌1次，胰酶消化培養(yǎng)基重懸后傳至2個(gè)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.5western blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá) CP70、CoC1、CAOV-4和IOSE80細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，胰酶消化收集細(xì)胞，2000 r/min離心5 min，獲得細(xì)胞斑塊。強(qiáng)效蛋白裂解液將細(xì)胞斑塊溶解后放置冰上完全裂解，14 000 r/min低溫離心后獲得蛋白上清液。采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，蛋白裂解液加入上樣緩沖液后煮沸變性。蛋白上樣后進(jìn)行凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)后將含有蛋白的PVDF膜放入封閉液中孵育1 h，TBST洗3次，PVDF膜放入一抗稀釋液中4℃孵育過(guò)夜。TBST洗3次，PVDF膜放入二抗稀釋液中室溫孵育2 h，ECL曝光條帶，采用ImageJ軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6PHF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 選擇PHF2表達(dá)低的卵巢癌細(xì)胞系進(jìn)行過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，胰酶消化收集細(xì)胞計(jì)數(shù)。以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞鋪至6孔板中，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，鋪板12 h后采用lip2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，對(duì)照質(zhì)粒和lip2000混勻后轉(zhuǎn)染至對(duì)照組細(xì)胞，PHF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和lip2000混勻后轉(zhuǎn)染至實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，采用western blotting檢測(cè)各組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染48 h的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，胰酶消化后采用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次后計(jì)數(shù)，以1.0×105個(gè)細(xì)胞加入PBS潤(rùn)濕的Transwell小室微孔膜上，將Transwell小室放置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后取出Transwell小室，PBS洗3次后，將小室放入甲醇溶液中固定15 min，吉姆薩染色15 min后，將微孔膜取出放置載玻片上封片。顯微鏡下拍照后計(jì)數(shù)各組細(xì)胞穿膜的數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)庫(kù)分析PHF2在卵巢癌組織的表達(dá) 采用癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(the cancer genome atlas, TCGA)分析PHF2在卵巢癌組織的表達(dá)水平，結(jié)果顯示426例卵巢癌組織中PHF2 mRNA的表達(dá)水平低于88例正常對(duì)照組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PHF2在卵巢癌組織的表達(dá)情況

2.2PHF2在卵巢癌組織的表達(dá) PHF2在卵巢癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常卵巢組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 卵巢癌和正常卵巢組織PHF2表達(dá)情況[例(%)]

2.3卵巢癌患者PHF2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 卵巢癌患者PHF2陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、組織類型、分化程度和有無(wú)脈管侵犯均無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 卵巢癌患者PHF2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

2.4PHF2蛋白在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 PHF2蛋白在卵巢癌細(xì)胞CP70、CoC1和CAOV-4中的表達(dá)分別為0.97±0.12、0.29±0.07和1.71±0.23，在人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80中的表達(dá)為2.98±0.31。PHF2蛋白在卵巢癌細(xì)胞CP70、CoC1和CAOV-4中的表達(dá)明顯低于正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80(P<0.01)，其中在CoC1細(xì)胞中的表達(dá)最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。故應(yīng)用CoC1細(xì)胞轉(zhuǎn)染PHF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。

圖2 PHF2蛋白在卵巢癌細(xì)胞和人正常卵巢上皮細(xì)胞中表達(dá)水平

2.5PHF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果 PHF2蛋白在實(shí)驗(yàn)組CoC1細(xì)胞中的表達(dá)為1.31±0.18，對(duì)照組CoC1細(xì)胞中的表達(dá)為0.37±0.10。PHF2蛋白在實(shí)驗(yàn)組CoC1細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。上述結(jié)果表明PHF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染CoC1細(xì)胞，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 2組卵巢癌CoC1細(xì)胞PHF2蛋白表達(dá)的情況

2.6PHF2對(duì)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響 對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)為201.67±15.85，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)為113.33±10.54。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 PHF2過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌CoC1細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響(吉姆薩染色 ×100)

2.7PHF2對(duì)卵巢癌細(xì)胞EMT的影響 PHF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞CoC1后，在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中E-cadherin蛋白的表達(dá)分別為0.41±0.16和1.08±0.07，N-cadherin蛋白的表達(dá)分別為0.37±0.09和0.11±0.03，vimentin蛋白的表達(dá)分別為1.22±0.30和0.29±0.08。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增加，N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 PHF2過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌CoC1細(xì)胞EMT的影響

3 討論

卵巢癌是一種嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤。在中國(guó)，2016年報(bào)告了5萬(wàn)多例新發(fā)卵巢癌病例和2萬(wàn)多例卵巢癌死亡病例[9]。目前卵巢癌的臨床治療策略非常有限，主要包括手術(shù)、化學(xué)療法和靶向治療藥物，對(duì)卵巢癌患者尤其是晚期患者的治療效果不佳[10-12]。由于卵巢癌早期癥狀不明顯，并且具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性，大部分患者確診時(shí)已是晚期，導(dǎo)致其5年生存率僅有30%左右[2]。腹膜內(nèi)侵入和轉(zhuǎn)移是卵巢癌惡性表現(xiàn)的重要特征[3]。近年來(lái)，許多研究都集中在卵巢癌的分子靶向治療上，其中抗血管生成藥、多腺苷二磷酸核糖聚合酶和葉酸受體靶向藥物等治療卵巢癌取得了一定的療效，但目前多處于臨床試驗(yàn)階段，因此迫切需要開(kāi)發(fā)新的潛在卵巢癌靶向藥物[13-14]。

PHF2是KDM7組蛋白脫甲基酶家族的成員，位于9q2染色體上，該家族在Jumonji-C和N端結(jié)構(gòu)域中包含植物同源結(jié)構(gòu)域。PHF2通過(guò)使H3K9me2脫甲基化，誘導(dǎo)與脂肪生成相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，在脂肪形成的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用[4]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中也存在表觀遺傳調(diào)控[15]，已經(jīng)在多種腫瘤類型中發(fā)現(xiàn)了PHF2的異常表達(dá)，PHF2的表達(dá)在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中顯著降低，而其低表達(dá)與白血病細(xì)胞增殖以及B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的不良預(yù)后標(biāo)志物升高相關(guān)[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在254例腎透明細(xì)胞癌中，PHF2高表達(dá)150例，低表達(dá)104例，但是PHF2的高表達(dá)與較低的Fuhrman核級(jí)、較小的腫瘤大小、較低的總分期和較長(zhǎng)的腫瘤特異性生存率以及無(wú)進(jìn)展生存期相關(guān)，而其低表達(dá)促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展[6]。但是，PHF2在卵巢癌中的表達(dá)水平未知，TCGA是包含卵巢癌在內(nèi)的31種惡性腫瘤的基因組公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)可以分析腫瘤組織和對(duì)照組織中差異表達(dá)的基因。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHF2 mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)水平低于正常對(duì)照組織，PHF2在卵巢組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，并且PHF2陽(yáng)性表達(dá)與卵巢癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期顯著相關(guān)。表明PHF2在卵巢癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用，與PHF2在其他腫瘤中的報(bào)道一致。

有研究報(bào)道，PHF2作為miR-221的靶基因影響肝細(xì)胞癌的細(xì)胞遷移能力，即PHF2低表達(dá)會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞遷移，PHF2在肝細(xì)胞癌組織中低表達(dá)與患者預(yù)后較差相關(guān)[7]。但PHF2與卵巢癌細(xì)胞的遷移能力是否相關(guān)未知，因此首先檢測(cè)了PHF2在卵巢癌細(xì)胞系和人正常卵巢上皮細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PHF2在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著低于人正常卵巢上皮細(xì)胞系，與在卵巢癌組織表達(dá)水平一致。選擇PHF2低表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系進(jìn)行PHF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PHF2過(guò)表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。上皮細(xì)胞能在特定的生理、病理?xiàng)l件下失去極性、黏附能力下降及細(xì)胞拉長(zhǎng)，表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞表型。生理性的EMT在胚胎發(fā)育、組織再生等正常生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，病理性的EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是包括卵巢癌在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[8,16-17]。EMT發(fā)生的早期E-cadherin表達(dá)降低，導(dǎo)致基底膜降解、細(xì)胞骨架改變、細(xì)胞活動(dòng)性增強(qiáng)，是EMT的重要誘發(fā)因素，E-cadherin蛋白在卵巢癌中低表達(dá)[18]。N-cadherin的高表達(dá)促使EMT的發(fā)生，可作為EMT的標(biāo)志物，N-cadherin在卵巢癌中高表達(dá)，且與卵巢癌組織分化差相關(guān)[19]。細(xì)胞骨架蛋白中另外一個(gè)重要成員vimentin是EMT的重要因子，vimentin高表達(dá)增加細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，使細(xì)胞與間質(zhì)充分接觸，促使細(xì)胞發(fā)生遷移，vimentin在卵巢癌中高表達(dá)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHF2能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中N-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin蛋白的表達(dá)，表明PHF2能夠抑制卵巢癌EMT的發(fā)生。

綜上所述，PHF2在卵巢癌細(xì)胞和組織中低表達(dá)，與卵巢癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期相關(guān)，PHF2可能通過(guò)抑制EMT的發(fā)生降低卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。PHF2可作為卵巢癌治療的潛在靶點(diǎn)。