紅背葉根對乙醇誘導的酒精性脂肪肝細胞模型的影響*

沈海容，王大東，羅顯克，王保健，吳曉莉，農云翠

廣西壯族自治區民族醫院:1.消化內科二區；2.消化內科一區，廣西南寧 530000

目前，我國成人脂肪肝發病率為12.5%～35.4%，且有逐年上升趨勢，而由飲酒過量引起的酒精性脂肪肝的發病率也越來越高[1]。酒精性脂肪肝發生肝纖維化和肝硬化的進程相對較快，并可能進展為肝癌。因此，積極研發治療酒精性脂肪肝的藥物對臨床意義重大。本課題組前期研究表明，紅背葉根對肝纖維化大鼠具有保肝、降酶和抗肝纖維化的作用[2-3]，但是酒精性脂肪肝離體細胞模型研究尚未開展。本研究采用乙醇誘導的酒精性脂肪肝離體細胞模型，進一步探討了紅背葉根對酒精性脂肪肝的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 紅背葉根采自廣東惠州，經南方醫科大學中藥鑒定與藥用植物教研室鑒定為大戟科植物紅背山麻桿的根。紅背葉根水提物提取步驟：紅背葉根干燥粉碎后，用蒸餾水溶解，離心取上清液，60 ℃水浴消毒3次。L02細胞(人胎肝細胞系)購自中國科學院上海細胞庫。

1.2儀器與試劑 高糖DMEM培養液購自美國Invitrogen公司；小牛血清(56 ℃、30 min滅活)購自浙江天杭生物科技有限公司；谷氨酰胺、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸、青-鏈霉素溶液購自吉諾生物醫藥技術有限公司；Biotek ELx800全自動酶標儀購自美國Biotek公司；Olympus Bx60倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養 L02細胞復蘇后用含10%小牛血清的DMEM培養液轉入玻璃培養瓶中，置于5% CO2、37 ℃的培養箱中飽和濕度條件下常規方法培養，2 d換液1次，3～4 d用0.25%胰蛋白酶消化，1∶3傳代培養。

1.3.2乙醇誘導建立酒精性脂肪肝L02細胞模型 將處于對數生長期的L02細胞消化后，以每孔5×104個細胞接種于96 孔板，培養4 h，待細胞貼壁后，更換培養液為含10% 小牛血清和不同水平乙醇(20、40、60、80、100 mmol/L )的DMEM培養液(乙醇組)，設置不含乙醇的培養液為對照組。在20 h 時，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL。繼續培養4 h，棄去培養液，每孔加入DMSO 200 μL，震蕩5 min后，采用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度(A)值。乙醇組細胞存活率=A乙醇組/A對照組×100%。

1.3.3紅背葉根對酒精性脂肪肝L02細胞模型中細胞存活率的影響 以80 mmol/L乙醇建立的酒精性脂肪肝L02細胞模型作為模型組(80 mmol/L乙醇處理L02細胞時，細胞存活率大于50%，因此選取該水平乙醇建立酒精性脂肪肝L02細胞模型)；分別用不同水平的紅背葉根水提物(12.500、6.250、3.125、1.560、0.780 mg/mL )作用于80 mmol/L乙醇建立的酒精性脂肪肝L02細胞模型(紅背葉根組)。在給藥20 h 時，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續培養4 h后，棄去培養液，每孔加入DMSO 200 μL，震蕩5 min后，采用酶標儀檢測490 nm波長處A值。模型組細胞存活率=A模型組/A對照組×100%，紅背葉根組細胞存活率=A紅背葉根組/A對照組×100%。

1.3.4丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)水平檢測 選取紅背葉根組中能使酒精性脂肪肝L02細胞模型中細胞存活率超過50%的紅背葉根水提物3個水平(3.125、1.560、0.780 mg/mL)下的細胞上清液，以及對照組、模型組的細胞上清液，進行細胞上清液中ALT、AST、GGT水平檢測。操作方法：細胞培養液以1 500 r/min離心5 min，取上清液備用；嚴格按各試劑盒使用說明書進行操作。

1.3.5超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平檢測 選取紅背葉根組中能使酒精性脂肪肝L02細胞模型中細胞存活率超過50%的紅背葉根水提物3個水平(3.125、1.560、0.780 mg/mL)下的細胞上清液，以及對照組、模型組的細胞上清液，按照試劑盒說明書操作，采用酶標儀檢測450 nm波長處SOD水平，檢測532 nm波長處MDA水平。

2 結 果

2.1不同水平乙醇對L02細胞存活率的影響 隨著乙醇水平升高，L02細胞的存活率逐漸下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2紅背葉根對酒精性脂肪肝L02細胞模型中細胞存活率的影響 紅背葉根組中，隨著紅背葉根水提物水平逐漸降低，酒精性脂肪肝L02細胞模型中細胞存活率逐漸升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 不同水平乙醇對L02細胞存活率的影響

表2 紅背葉根對酒精性脂肪肝L02細胞模型中細胞存活率的影響

2.3各組ALT、AST、GGT水平比較 與對照組比較，模型組酒精性脂肪肝L02細胞模型的細胞上清液中ALT、AST、GGT水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，紅背葉根組3個水平(3.125、1.560、0.780 mg/mL)下，酒精性脂肪肝L02細胞模型的細胞上清液中ALT、AST、GGT水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4各組SOD、MDA水平比較 與對照組比較，模型組酒精性脂肪肝L02細胞模型的細胞上清液中SOD水平明顯降低，MDA水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，紅背葉根組3個水平(3.125、1.560、0.780 mg/mL)下，酒精性脂肪肝L02細胞模型的細胞上清液中MDA水平明顯降低，SOD水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 各組ALT、AST、GGT水平比較

表4 各組SOD、MDA水平比較

3 討 論

脂肪肝可分為酒精性脂肪肝與非酒精性脂肪肝。研究脂肪肝的發病機制時常用到酒精性脂肪肝細胞模型和非酒精性脂肪肝細胞模型。研究表明，動物模型存在個體差異較大，實驗條件不易控制，整體影響因素眾多等不利因素，而建立細胞模型能克服動物模型個體差異的影響，更好地控制實驗條件，能針對性地探討脂肪肝發病的細胞機制，且能有效縮短篩選治療藥物的時間[4]。本課題組前期研究已使用動物模型探討過紅背葉根的保肝機制[2-3]，但未進行過離體細胞模型的研究，且目前相關臨床研究較少，因此，在本研究中采用酒精性脂肪肝離體細胞模型初步探討了紅背葉根對酒精性脂肪肝的影響。

本研究中，隨著乙醇水平升高，L02細胞的存活率逐漸下降，提示在酒精性脂肪肝的發生、發展過程中，乙醇導致的肝損傷起到關鍵作用。本研究紅背葉根組中，隨紅背葉根水提物水平的逐漸降低，乙醇誘導的酒精性脂肪肝L02細胞模型中細胞存活率逐漸升高，當其水平為1.560、0.780 mg/mL時，其所對應的細胞存活率高于模型組，提示該水平下紅背葉根具有一定的保肝作用，與本課題組前期的動物模型研究結果一致。

脂質過氧化及氧化應激是急性肝損傷的一個發病機制。肝細胞發生過氧化損傷時，細胞膜通透性增加，ALT和AST從肝細胞內釋放，細胞培養液中的ALT和AST水平升高[5]。ALT主要存在于肝細胞的細胞質中；AST主要存在于肝細胞的細胞質和線粒體中；GGT分布于肝細胞膜，乙醇能誘導微粒體生物轉化，使GGT水平升高。ALT、AST及GGT是肝細胞內的非特異性功能酶，當細胞發生損傷時其水平升高[6-7]。乙醇及其代謝物乙醛能促進脂質過氧化和線粒體的損傷，從而引起肝細胞損傷，使相關生化指標產生相應變化[6-8]。本研究結果顯示，紅背葉根可降低酒精性脂肪肝L02細胞模型的細胞上清液中ALT、AST、GGT水平，提示紅背葉根在酒精性脂肪肝離體細胞模型中具有保肝、降酶的作用。

脂質過氧化的主要降解產物MDA可直接與蛋白和DNA結合，使之變性失活，因此MDA常用于反映人體內脂質過氧化的程度及細胞氧化損傷的程度[9]。此外，MDA可嚴重損傷肝細胞膜結構，導致肝細胞腫脹、壞死[10]。SOD是人體內自由基的重要清除劑，可防止生物膜過氧化引起的毒性作用[11]。據報道，各類型肝病患者SOD水平均明顯降低，且其與肝臟病理損傷嚴重程度有關[12]。本研究結果顯示，紅背葉根還可以明顯降低酒精性脂肪肝L02細胞模型的細胞上清液中MDA水平，明顯提高SOD水平，提示紅背葉根在酒精性脂肪肝離體細胞模型中具有抗脂質過氧化的作用。

本研究結果為紅背葉根在酒精性脂肪肝中的臨床應用提供了有力的數據支撐。但本研究的局限性在于使用的是體外實驗模型，不能完全模擬體內的生理病理變化。

綜上所述，紅背葉根在酒精性脂肪肝細胞模型中具有保肝、降酶、抗脂質過氧化的作用，值得進一步臨床試驗驗證后推廣應用。