東港市豬主要寄生蟲病流行情況調查

邱吉源

（東港市農業農村發展服務中心，遼寧東港 118300）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

取自東港市某豬場仔豬拉稀糞便。病豬的中后段空腸有卡他性或局灶性、偽膜性炎癥，空腸和回腸黏膜表面有斑點狀出血和纖維素性壞死斑塊，腸系膜淋巴結水腫性增大。顯微鏡下觀察可見腸絨毛的萎縮、融合，腸隱窩增生、濾泡增生和壞死性腸炎，腸上皮細胞灶性壞死，在絨毛頂端有纖維素性壞死物，并可在上皮細胞內見到大量成熟的裂殖體、裂殖子等內生性階段蟲體。

1.1.2 引物設計

根據 Genbank 上的 Isospora suis 18SrRNA 基因全序列（U97523）設計一對特異性引物，擬擴增產物 1178bp。上游引物 5-ACCCACCTTCTGGTGGTCCTCAGGT-3；下游引物 5-CACGCAAAGTCCTCTAAGAAGTGATA-3。

1.1.3 主要試劑和器材

UNIQ-10 柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒。上海生物工程有限公司，Taq 酶 Takara 公司（大連），PMD18-T Uector Takara 公司（大連），膠回收試劑盒杭州博日科技有限公司，DL2000 Marker BBI公司（美國），移液槍 Eppendorf 公司（德國），生物安全柜 蘇凈集團安泰公司，UNO II PCR 儀 Biometra 公司（德國），DYY 8C 電泳儀北京六一儀器廠，MiniBis Pro 凝膠成像系統DNR公司（以色列），Percellys 24 多功能樣品均質器 Benin Technologies 公司（法國）。

1.2 方法

1.2.1 豬等孢球蟲卵囊的收集

取鏡檢卵囊較多的仔豬糞便 10g 于自來水中混勻，用 60 目糞篩過濾，3000r/10min，棄上清液，沉淀于飽和鹽水中漂浮 30min左右，吸取上層液置 2.5%重鉻酸鉀溶液中。

1.2.2 豬等孢球蟲卵囊的純化

將收集的濾液 3000r/min，離心 10min，棄上清液，加入 10 倍體積清水混勻后3000r/min，再離心 10min。洗滌 3 次后加入 5 倍體積飽和食鹽水 3000r/min，離心 10min。表面漂浮的白色物質即是卵囊。經過孢子化檢查發現，大部分孢子化卵囊為 4 個子孢子，內含 2 個孢子囊的豬等孢球蟲。少數卵囊為 2 個子孢子，內含 4個孢子囊的豬艾美爾球蟲。

1.2.3 豬等孢球蟲卵囊 DNA 的提取

取研磨好的樣品 200μl，加入 200μlDigestion Buffer，混勻；加入 20μlProteinaseK，混勻，55℃保溫 30min。加入 200μlBD Buffer，70°C 溫育 10min。加入 200μl無水乙醇，混勻。然后加入 UNIQ-10 柱。10000r/min，離心 1min.丟棄廢液。加入500μL PW Solution，10000r/min，室溫離心 1min。丟棄廢液。加入 500μl Wash Solution，10000r/min，室溫離心 1min。丟棄廢液。室溫離心 1min。加入新的 1.5ml 離心管。在柱子中央加入 50μl 60℃預熱的 Elution Buffer，放置 5min。10000r/min。提取好的DNA 放于-20℃ 冰箱保存。

1.2.4 特異性試驗

應用本引物，對豬球蟲 DNA、弓形蟲 DNA、大腸桿菌 DNA及附紅細胞體DNA 進行 PCR 擴增，驗證該引物的特異性。

1.2.5 敏感性實驗

將豬等孢球蟲進行麥克馬斯特計數，計算得豬等孢球蟲卵囊為 2×104個 /ml。將卵囊稀釋為 2×104個 /ml，1×104個 /ml，8×103個 /ml，5×103個 /ml，2×103個 /ml。

1.2.6 臨床樣本檢查

應用本引物，對鏡檢蟲卵較多的仔豬糞便進行卵囊純化，然后提取 DNA 進行 PCR 檢測。

2 結果

2.1 PCR 擴增結果

將豬球蟲提取基因組DNA后用引物進行PCR擴增，經過瓊脂糖凝膠電泳后，其大小約1200bp，與預期一致。

2.2 測序結果分析

上述 PCR 產物經上海生工測序，應用 DNAstar 軟件，與NCBI 收集的豬球蟲序列進行比對，發現序列同源性為 99.7%。經 DNAstar 進行序列分析可以看出 11 種原蟲處于 2 個進化枝上。其中測序株，isospora suis、sp.Harbin、ohioensis、orlovi、belli、felis、toxoplasma gondi在第一枝，eimeria porci、scalcra、polita 位于第二枝。第一枝中，同源性都達到97%以上，其中 ohioensis、orlovi、sp.Harbin 與測序株同源性高達 99%以上，與下載序列（U97523）isospora suis 同源性高達 99.7%，說明所擴增序列達到預期要求，該測序株為豬等孢球蟲。與第二枝上的艾美爾球蟲同源性差距較大，說明等孢球蟲和艾美爾球蟲同源性較低。

2.3 特異性試驗

將提取的豬球蟲 DNA 和已知的弓形蟲 DNA、大腸桿菌DNA、附紅細胞體DNA 用合成的引物進行 PCR 擴增，只有豬球蟲 DNA 樣品有 1200bp 條帶。其他均無條帶。

2.4 敏感性試驗

經過 PCR 擴增，顯示該方法最低可以檢測豬等孢球蟲卵囊數量為5×103個/ml。

2.5 臨床檢測

取 10 份仔豬糞便進行鏡檢和 PCR 擴增，其中陽性糞便均擴增出約 1200bp大小條帶。

3 討論

隨著現代養殖方式發生變化，由過去的散養變為現在的集約化養殖，豬球蟲的感染率變高，尤其以等孢球蟲的危害更為嚴重。等孢球蟲多見于仔豬，可引起仔豬腹瀉，體重變輕，嚴重的甚至引起仔豬糞便帶血。

目前國內外對等孢球蟲 PCR 研究做的比較少，其中 Johanna Johnson等用 PCR 方法檢測豬等孢球蟲，B.Ruttkowski等用 PCR方法鑒定艾美爾球蟲和豬等孢球蟲，我國劉長輝等（2007）建立豬等孢球蟲 PCR 診斷方法，姚雷等（2007）建立豬等孢球蟲巢式PCR 診斷方法。為本次試驗提供了研究方向。

豬糞便中雜質較多，而且有時會出現艾美爾球蟲和等孢球蟲混合感染的情況。對于豬等孢球蟲的鑒定需要經過 4 天孢子化才能確定，需要的時間較長應用本法可以準確判斷是否感染豬等孢球蟲。該 PCR 檢測方法對豬等孢球蟲孢子化卵囊和未孢子化卵囊均能擴增出特異性條帶，說明可以直接選擇新鮮糞便進行 PCR 檢測，無需進行孢子化，縮短了檢測時間。特異性試驗表明，該實驗對于其他相關蟲體均無交叉反應，說明具有較高的特異性。因為 PCR 方法需要的儀器和試劑費用較高，所以該方法應該作為輔助檢測而不能完全代替傳統的顯微鏡檢查。

4 結論

通過這次調查發現：豬胃腸道寄生蟲調查的 1087 份樣品，其中豬蛔蟲陽性樣品 49 份，陽性率為 4.51%。豬結節蟲陽性樣品13 份，陽性率為 1.19%，豬類圓線蟲陽性樣品為 29 份，陽性率為 2.67%，豬鞭蟲陽性樣品 17 份，陽性率為1.56%。豬球蟲陽性樣品為 209 份，感染率為 19.23%，豬結腸小袋纖毛蟲陽性樣品為341 份，感染率為 31.37%。

根據 Genbank 上的 Isospora suis 18SrRNA 基因全序列（U97523）設計 1對特異性引物，建立豬等孢球蟲病的 PCR 診斷方法并進行了敏感性和特異性實驗。此方法可以快速診斷豬等孢球蟲的感染，縮短了孢子化的時間，極大的提高了檢測效率。