小鼠組織石蠟切片制作中的問題探討

李汝佳 孫艷芹 甘思遠(yuǎn)

（1 廣東醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系 廣東 湛江 524023）

（2 廣東醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系 廣東 東莞 523808）

石蠟切片技術(shù)是形態(tài)學(xué)和病理學(xué)研究領(lǐng)域中最基本的研究手段，是組織病理學(xué)制片技術(shù)中最常用的方法，在科研工作中多需要對(duì)小鼠的組織做石蠟切片。而小鼠的組織較人體組織塊小質(zhì)嫩柔軟，若按照跟人體組織一樣的制作方法，會(huì)使小鼠變硬變脆，所以通過(guò)不斷的實(shí)驗(yàn)，依據(jù)不同組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和組織學(xué)性質(zhì)的差異，在制作石蠟切片時(shí)對(duì)其每個(gè)步驟包括取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、封片等選擇各自適宜方法，才能做出高質(zhì)量的切片，如果在任何一個(gè)環(huán)節(jié)上出現(xiàn)失誤都會(huì)影響到切片的質(zhì)量，最終影響對(duì)結(jié)果的判斷。

我們總共取了小鼠的腦、肺、心臟、肝臟組織做實(shí)驗(yàn)，在制作切片的過(guò)程中對(duì)遇到的問題進(jìn)行探討，尋找到正確的解決方法。現(xiàn)總結(jié)如下。

首先，對(duì)小鼠腦、肺、心臟、肝臟組織要充分的固定。固定液常用40%的甲醛和水按1 ∶9 配制成10%甲醛溶液，這是最簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的固定液。處死小鼠后取出腦、肺、心臟、肝臟組織先用生理鹽水沖洗一下，盡可能清除掉無(wú)用的黏連組織，不可以擠壓組織，然后迅速放到固定液中，使組織細(xì)胞迅速凝固，防止組織的腐敗和自溶。固定液的量一般要為組織的10 倍，才能使其充分固定，根據(jù)組織的大小來(lái)確定固定時(shí)間，一般為l2 ～24 小時(shí)。

其次，要嚴(yán)格控制小鼠的脫水、透明、浸蠟的時(shí)間以及每個(gè)步驟的注意事項(xiàng)。脫水劑常用乙醇，脫水的時(shí)候酒精要按照低濃度到高濃度酒精進(jìn)行梯度脫水。如脫水時(shí)間不足，會(huì)造成組織發(fā)軟、凹陷。可脫水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)造成組織過(guò)硬。脫水劑要經(jīng)常更換，避免長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)使脫水劑的濃度不達(dá)標(biāo)，從而造成組織脫水不良。如不能及時(shí)完成脫水過(guò)程，組織可在低濃度的乙醇中放置時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)，但不能在無(wú)水乙醇內(nèi)放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。透明劑使用二甲苯的效果最好，但應(yīng)嚴(yán)格控制其時(shí)間。時(shí)間不夠使組織不能完全透明，乙醇不能被完全置換出來(lái)，導(dǎo)致下一步的浸蠟中，石蠟不能浸透到組織中[1]。但在二甲苯中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致組織變硬變脆，切片時(shí)不易切出完整的切片。浸蠟所使用的石蠟熔點(diǎn)是58℃，時(shí)間同樣不可以過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)槭瀸?duì)組織也有一定的收縮作用。浸蠟的溫度也不宜過(guò)高，控制在六十度，否則都會(huì)使組織變硬。

應(yīng)視組織的性質(zhì)類型及其大小分別安排脫水時(shí)間。腦組織其含水分多纖維成分少，透明、浸蠟的時(shí)間都要延長(zhǎng)。心肺組織因柔軟疏松故脫水時(shí)間也應(yīng)延長(zhǎng)。而實(shí)質(zhì)性器官肝組織因其結(jié)構(gòu)緊密，所以其在脫水，透明、浸蠟的時(shí)間要比跟其他組織都要時(shí)間短，尤其是高濃度酒精容易使組織收縮和硬化，所以不能脫水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則組織變硬變干，組織切下來(lái)就變成粉末，切片破碎，變成空洞或不成形[2]。

通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，我們將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠腦、肺、心臟、肝臟組織的脫水、透明、浸蠟等所需的具體的適宜時(shí)間介紹如下，見表。

表 小鼠腦、肺、心臟、肝臟組織脫水、透明、浸蠟時(shí)間

最后，小鼠腦、肺、心臟、肝臟組織在包埋、切片、染色中的注意事項(xiàng)。

制作出優(yōu)質(zhì)的石蠟切片的基礎(chǔ)就是制備出合格的動(dòng)物組織包埋蠟塊。需要6O℃石蠟包埋制成蠟塊，然后切片，切片厚度為3 ～5μm。漂片的時(shí)候?yàn)榱朔乐骨衅欛尢啵荒芡耆归_，可以先讓切片放在35%～40%酒精上拿鑷子輕輕的展開切片，待平整后再撈進(jìn)攤片機(jī)攤片，攤片機(jī)水溫控制在40～45℃，待切片完全展開后就可以撈片。其中包埋時(shí)需要特別注意的是肺組織由于過(guò)輕會(huì)浮于液體表面要在包埋時(shí)可等蠟在包埋模里稍冷卻一下，肺組織才可固定在包埋框的下面，可以防止其漂浮起來(lái)[3]。

染色采用改良?xì)W力式蘇木素染液進(jìn)行HE 染色，步驟如下：先脫蠟，二甲苯I10min、二甲苯Ⅱ5min，95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅲ各片刻，流水洗2min；再染色，蘇木素10min，流水洗1min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水洗10 ～15min，0.5%伊紅乙醇10 ～15s，75%乙醇、85%乙醇0.5min、95%乙醇、100%乙醇各0.5min。這個(gè)時(shí)間只能作為參考，染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同的組織，溫度濕度具體而定。封片采用中性樹膠加少量二甲苯，樹膠和二甲苯的比例大概為2 ∶1，不能太稀，不然膠干了以后會(huì)有空洞。這樣既可以達(dá)到透明的目的，又能避免吸入過(guò)多的二甲苯氣體[4]。

綜上所述，我們針對(duì)小鼠組織石蠟切片制作中遇到的問題，積極尋找原因解決問題，經(jīng)過(guò)實(shí)踐研究改進(jìn)方法，只要前期處理好，切出的蠟片就會(huì)完整，之后無(wú)論是做HE 染色還是做免疫組化都不會(huì)出現(xiàn)脫片的現(xiàn)象，鏡下可見著色均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，從而可正確的觀察和判斷組織的原始形態(tài)結(jié)構(gòu)。只有把石蠟切片制作過(guò)程中每一個(gè)細(xì)節(jié)都把握精準(zhǔn)，才能避免組織塊變硬變脆，制作出高質(zhì)量的小鼠各組織石蠟切片，為提高科研工作水平創(chuàng)造條件。