順鉑和20(R)-人參皂苷Rg3的HPLC分析和雙載藥緩釋抗癌藥物制備研究

陳定寧 許 雯 沈昊宇

(1.浙大寧波理工學院，寧波315100; 2.浙江大學校醫院內科，杭州 310027; 3.浙江大學化學工程與生物工程學院，杭州 310027)

研究發現，癌癥已成為世界上影響人類健康的重要疾病，化學療法是癌癥治療中最常用的方法之一[1，2]。化療藥物普遍存在水溶性差、生物膜滲透率低、缺乏分子靶向性等缺陷使得此類藥物在體內的代謝效果不佳，對人體產生一系列的不良反應從而造成不可逆轉的傷害。因此構建一種新型的靶向性藥物傳遞系統，使藥物濃集于病灶達到增加療效、降低藥物毒副作用的目的，已經成為抗癌藥物研發的熱點[3]。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是由兩種單體即乳酸(LA)和羥基乙酸(GA)按不同比例縮聚而成的一種可降解的高分子線性聚合物，如PLGA 80:20(80% LA和20% GA組成)，PLGA 75:25，PLGA 50:50[4]。PLGA因具有良好的生物兼容性、可降解性、合成簡單、穩定性高、降解速度可調節及可塑性好等特點，現已廣泛應用于臨床醫學領域[5-7]。

大量藥理實驗數據表明[8-10]，順鉑(CDDP)和20(R)-人參皂苷Rg3(Rg3)在癌癥治療具有顯著作用。為進一步提高CDDP和Rg3的生物利用率和臨床療效，本研究以PLGA為基底材料，同時包埋CDDP和Rg3制備得PLGA-CDDP/Rg3納米粒，并建立緩釋藥物的高效液相色譜檢測方法研究其緩釋效果。該方法檢出限低，分析速度快，精密度好，儀器性價比高，適用于該雙載藥系統的研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(Ultimate 3000, Thermo Fisher Scientific)，帶有紫外檢測器；電子天平；水浴鍋；細胞粉碎機；冷凍干燥機。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物；順鉑；20(R)-人參皂苷Rg3；甲醇；乙腈；二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DDTC)；氯化鈉; N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；聚乙烯醇(PVA)

1.2 PLGA-CDDP/Rg3的制備

取一定量CDDP和Rg3分散于PLGA的DMF溶液中，超聲至粉末完全溶解形成W/O初級乳液。將初級乳液滴加至15mL 1% PVA(w/v)水溶液中，超聲混勻形成W/O/W乳液。然后緩慢滴加等體積2%(w/v)異丙醇溶液，室溫下攪拌3 h直至有機相完全揮發。收集的微球用少量去離子水洗滌并冷凍干燥，即得到PLGA-CDDP/Rg3納米粒，4℃保存備用。

按上述步驟制備不含CDDP和Rg3的PLGA納米粒作為輔料對照。

1.3 實驗方法

1.3.1溶液的制備

(1)標準儲備液

CDDP標準儲備液：精密稱取CDDP標準品50 mg于燒杯中，加入質量分數為0.9%的NaCl溶液溶解，轉移至50 mL容量瓶并加0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，制成1000 mg/L的標準儲備液。

Rg3標準儲備液：精密稱取Rg3標準品50 mg置燒杯中，用少量甲醇溶解后加水混合均勻，轉移至50 mL容量瓶中并加水稀釋至刻度，制成1000 mg/L的標準儲備液。

(2)樣品溶液

樣品溶液1(CDDP)：精密稱取PLGA-CDDP/Rg3納米粒10 mg于燒杯中，加入質量分數為0.9%的NaCl溶液溶解，轉移至100 mL容量瓶并加0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，制成100 mg/L的樣品溶液1。

樣品溶液2(Rg3)：精密稱取PLGA-CDDP/Rg3納米粒10 mg于燒杯中，加入去離子水溶解，轉移至100 mL容量瓶并加去離子水稀釋至刻度，制成100 mg/L的樣品溶液2。

(3)空白輔料溶液

精密稱取適量PLGA納米粒，按“1.3.1(2)”項下方法進行操作，制成空白輔料溶液。

1.3.2順鉑柱前衍生化方法

取0.5 g DDTC溶于0.1 mol/L NaOH溶液中，配制成5%的DDTC溶液(每次需新鮮配制)。

將500 μL已知濃度的CDDP溶液和50 μL 5% DDTC溶液在37℃水浴中避光混合30 min，制得Pt(DDTC)2(經三氯甲烷萃取后進HPLC分析)。。

1.3.3色譜條件

順鉑：Welch welchrom C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(70∶30，V∶V)；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL。

人參皂苷Rg3：Welch welchrom C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(45∶55，V∶V)；檢測波長：203 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL。

2 結果

2.1 專屬性考察

精密量取一定濃度的標準儲備液、樣品溶液和空白輔料溶液20 μL(CDDP按“1.3.2”方法進行預處理，下文均進行此處理)，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。由圖1可知，輔料不干擾樣品測定，專屬性較高。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 線性關系考察

取CDDP和Rg3標準儲備液適量，分別稀釋制成0.1～50 mg/L和0.5～50 mg/L系列溶液。以衍生化產物Pt(DDTC)2和Rg3峰面積與藥物濃度進行線性回歸，回歸方程為y=0.8598x-0.3859(R2=0.9993)，y=0.0916x-0.0218(R2=0.9997)。最低檢測限分別為0.0459和0.0365 mg/L，見圖2。

圖2 CDDP和Rg3標準曲線

2.3 納米球的載藥率及包封率

CDDP和Rg3以固體的形式包裹于PLGA，需將藥物全部溶出，再測定其含量。故取10 mg冷凍干燥后的納米粒于10 mL溶劑中，避光條件下超聲1 h，按相應方法測峰面積，根據回歸方程計算CDDP和Rg3的含量，并計算載藥率和包封率，結果如表1所示。

表1 PLGA-CDDP/Rg3納米粒的包封率和載藥率

2.4 納米球的體外釋放測試

準確稱取一定量CDDP、Rg3和PLGA-CDDP/Rg3納米粒分散于相應溶劑中，在避光條件下，每隔一段時間取出一定量溶液，并替換新鮮等量的溶劑。分別按上述方法進行柱前衍生和直接進樣，計算CDDP和Rg3釋放量。如圖3所示，相比較于CDDP和Rg3直接分散于溶劑，包裹PLGA后的納米粒緩釋效果明顯。在48 h和24 h時，CDDP和Rg3的釋放量分別達到頂峰85.07%和78.18%，體現了緩釋微球的良好的緩釋性能。

圖3 CDDP和Rg3體外累計釋放曲線

2.5 精密度考察

取低、中、高濃度(0.5、10.0、50.0 mg/L)的CDDP和Rg3標準溶液，進樣6次，分別計算CDDP和Rg3峰面積的RSD值為0.32%、0.13%、0.56%和0.37%、0.05%、0.78%，可見精密度良好。

2.6 加標回收考察

稱取CDDP和Rg3已測定的緩釋粉末各9份，置于30 mL螺口瓶中，按照CDDP和Rg3含有量50%、100%、150%加入標準品，每組各3份，HPLC測定CDDP和Rg3總含量，計算得平均加標回收率為99.09%和101.59%，RSD值為1.78%和1.32%。

3 討論

CDDP和Rg3雖被廣泛用于癌癥治療，但因其低水溶性和生物相容性差等缺點而限制了其應用。在低水溶性的抗癌藥物上修飾高分子聚合物，可以極大地增強其水溶性和分子靶向性能力，同時達到緩釋作用。雖然醫藥輸送體系已經在醫學研究上得到廣泛應用，但現在大多數研究都只是建立單個藥物的輸送體系，臨床應用中多種藥物聯合治療的方式更為普遍。因此聯用不同藥學機制的藥物研發出多重藥物輸送體系，可在疾病治療中發揮更好的作用。

本研究采用制備工藝簡單、容易實現規模化生產的微囊化技術制備CDDP、Rg3雙藥聯合緩釋藥物和對緩釋效果進行研究。結果顯示，該緩釋藥物的對CDDP和Rg3平均包封率為85.82% ± 3.47%、91.36% ± 5.21%，載藥率為70.18% ± 0.97%、67.59% ± 2.64%。并且在體外具有明顯地緩釋特征，分別在48 h和24 h內CDDP和Rg3的累積釋放率達85.07%和78.18%。利用該技術制備的微球/微囊、納米粒/納米囊是一種有效的藥物緩釋手段，可提高口服藥物的活性和生物利用度，通過非胃腸道給藥明顯延長藥效，富集于靶器官和組織，降低全身毒副作用，對新藥研制開發具有重大應用前景。

在緩釋研究方面，本實驗采用HPLC法檢測CDDP和Rg3的含量，分別在254nm和203nm處可檢測到相應的吸收峰，檢出限在0.0459～0.0365 mg/L之間，精密度RSD均低于0.78%。且該方法簡單便捷，靈敏度高，對藥物中的CDDP和Rg3的含量檢測具有重要意義。