脲酶—谷氨酸脫氫酶法快速測(cè)定黃酒及其發(fā)酵液中的尿素

高紅波 仇 凱 李國(guó)輝 吳 剛 屠振華 鄭 淼 陳楠楠 鐘其頂*

(1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100015;3.食品行業(yè)生產(chǎn)力促進(jìn)中心，北京 100062)

黃酒是我國(guó)民族特產(chǎn),含有豐富的營(yíng)養(yǎng)組分深受廣大人民的喜愛(ài)，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒。隨著人們對(duì)食品安全的日益關(guān)注以及對(duì)發(fā)酵酒安全性的重視，研究發(fā)現(xiàn)黃酒中含有氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC，又叫Urethane)[1,2]，EC是一種多點(diǎn)致癌物廣泛存在于發(fā)酵食品,[3,4]，已被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列入人類潛在致癌物質(zhì)(2A 類),加拿大、美國(guó)、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織等已對(duì)酒精飲料中EC的含量規(guī)定了限量標(biāo)準(zhǔn)[1]，我國(guó)尚未制定酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，黃酒中含有的尿素是形成氨基甲酸乙酯最主要的前體物質(zhì)[1]，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 34266—2017《黃酒中氨基甲酸乙酯預(yù)防控制措施指南》及文獻(xiàn)中指出黃酒中 EC 主要源尿素與乙醇反應(yīng)，且EC生成速率與其尿素含量，貯存時(shí)間 溫度正相關(guān)[5-9]，因此建立黃酒及發(fā)酵過(guò)程中尿素的準(zhǔn)確快速檢測(cè)方法，對(duì)開(kāi)展降低黃酒中EC含量的控制措施具有重要的意義。

目前，發(fā)酵酒中尿素的檢測(cè)方法主要有化學(xué)比色法[10-13]，柱前衍生-液相色譜熒光法法[14-18]分離和液相質(zhì)譜法[19]和脲酶法，即尿素經(jīng)脲酶水解后產(chǎn)生氨和二氧化碳，通過(guò)檢測(cè)氨或二氧化碳測(cè)定尿素含量[20-22]。其中化學(xué)比色法需水浴加熱，操作繁瑣，且易受黃酒中共存組分干擾；高效液相色譜法測(cè)定周期較長(zhǎng)，無(wú)法滿足黃酒釀造過(guò)程中尿素含量呈動(dòng)態(tài)變化快速測(cè)定；酶法特異性好、速度快，適合對(duì)黃酒及發(fā)酵液中尿素快速監(jiān)測(cè)，但是黃酒中內(nèi)源氨是尿素含量的6～10倍左右，根據(jù)黃酒中尿素的測(cè)定原理，內(nèi)源氨嚴(yán)重干擾尿素的測(cè)定[23]。

本實(shí)驗(yàn)篩選不同的類型的離子交換樹(shù)脂，開(kāi)展離子交換樹(shù)脂除去黃酒中內(nèi)源氨的研究，對(duì)離子交換樹(shù)脂的洗脫液種類、洗脫液體積和洗脫液pH值等條件進(jìn)行了選擇和優(yōu)化，最終確定離子交換樹(shù)脂最佳前處理?xiàng)l件，可除去90 %的內(nèi)源氨，消除了氨對(duì)尿素測(cè)定的干擾。將該前處理方法與脲酶-谷氨酸脫氫酶法結(jié)合，對(duì)黃酒及其釀造過(guò)程發(fā)酵液中的尿素進(jìn)行了檢測(cè)，并與柱前衍生高效液相色譜-熒光法[17]進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)方差分析和T檢驗(yàn)說(shuō)明兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，為適黃酒企業(yè)快速監(jiān)控黃酒和黃酒釀造過(guò)程尿素含量提供了一個(gè)有效途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Arena 20XT全自動(dòng)生化分析儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；高效液相色譜儀(Waters2695配熒光檢測(cè)器)；液相色譜柱(美國(guó)Waters公司，Atlantis dC18 (250 × 4.6 mm, 5 μm)，分析天平(梅特勒，感量0.0001g)；漩渦混合器(太倉(cāng)市科教器材廠)；玻璃層析小柱(22×1.5(內(nèi)徑)cm)定制。

1.2 試劑和耗材

3種強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(001×1、001×7、001×14.5，天津南開(kāi)和成科技有限公司)；氨試劑盒、尿素試劑盒均為賽默飛世爾(中國(guó))科技有限公司；乙腈(色譜純)、9-占頓醇(美國(guó)Sigma公司)、尿素(純度99%，美國(guó)百靈威化學(xué)試劑公司)、硫酸氨、氫氧化鈉、濃鹽酸均為分析純；黃酒及黃酒釀造過(guò)程為黃酒廠家提供，水為二次蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)原理

首先一分子的尿素((NH2)2CO)在脲酶(Urease)的催化作用下轉(zhuǎn)化為二分子的氨離子(NH4+)，見(jiàn)反應(yīng)(1)；隨后氨離子(NH4+)與酮戊二酸(2-oxoglutarate)在谷氨酸脫氫酶(GLDH)的催化作用下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-谷氨酸(L-Glutamate)，同時(shí)等摩爾數(shù)的NADH轉(zhuǎn)變成NAD+，見(jiàn)反應(yīng)(2)，為了減去樣品中原來(lái)含有的游離氨，需同時(shí)對(duì)樣品中游離氨進(jìn)行檢測(cè)，游離氨的檢測(cè)單獨(dú)使用氨試劑盒，只經(jīng)過(guò)反應(yīng)(2)。Arena分析儀通過(guò)分光光度法測(cè)定NADH在340nm波長(zhǎng)下的吸光度變化，即可得出氨的濃度，隨后根據(jù)公式(3)計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的尿素的含量。

(1)

(2)

由于1 mol尿素分解得到2 mol氨離子，其分子量比值為：MW(尿素/氨)=60.06/(2×18)=1.668，分解得到的氨離子和溶液中的氨離子按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，測(cè)得的總氨離子含量扣除溶液中的游離氨離子濃度，尿素含量的結(jié)果是通過(guò)分析儀自動(dòng)運(yùn)行以下公式實(shí)現(xiàn)的：

尿素(mg/L)=(總氨離子(尿素分解氨和游離氨)(mg/L)-游離氨(mg/L))×1.668

(3)

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和定標(biāo)液的配制

尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.1000g尿素，用水溶解后定容至100mL，配制成尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000 mg/L)于4 ℃冷藏，準(zhǔn)確吸取該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液50 μL，用水稀釋至1000 μL，得50 mg/L尿素定標(biāo)液。

氨根標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.3677g硫酸氨，用水溶解并定容至100 mL，根據(jù)硫酸氨和氨根離子的分子量，換算成氨根離子濃度為1000mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于4 ℃冷藏。準(zhǔn)確吸取該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液50 μL，用水稀釋至1000 μL，得50 mg/L氨根離子作為定標(biāo)液，定標(biāo)液現(xiàn)配現(xiàn)用。其中硫酸氨((NH4)2SO4)分子量是132.14，氨根的相對(duì)分子量是18，因此硫酸氨質(zhì)量濃度與氨根質(zhì)量濃度的轉(zhuǎn)換系數(shù)為：C氨=C硫酸氨×36/132.14=C硫酸氨×0.272。

1.4.2樣品前處理

強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(001×1型樹(shù)脂)用水浸泡24小時(shí)，用2倍樹(shù)脂體積的4%鹽酸，通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡2～4小時(shí)，用去離子水通過(guò)樹(shù)脂層，洗至出水酸度穩(wěn)定pH 2～3；用2倍樹(shù)脂體積的2 %氫氧化鈉溶液，通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡2～4小時(shí)，用去離子水通過(guò)樹(shù)脂層，洗至出水酸度穩(wěn)定pH 8～10。反復(fù)3次后，用4 %的鹽酸將Na型樹(shù)脂轉(zhuǎn)換為H型樹(shù)脂即可使用。將處理好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂裝入離子交換柱(22×1.5(內(nèi)徑)cm)中，柱高2.5 cm。取10 mL黃酒樣品加入離子交換柱內(nèi)，收集流出液，分次用純凈水洗脫(每次1 mL)，收集20 mL，混勻，取1 mL進(jìn)樣測(cè)定。

1.4.3Arena20XT全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定參數(shù)

氨根測(cè)定采用氨試劑盒。根據(jù)儀器的測(cè)定條件，進(jìn)樣量：5μL；試劑1：100μL；試劑2：25μL；試劑3：25μL；加入試劑2孵育300s，讀取空白值；加入試劑3孵育360s，讀終點(diǎn)。測(cè)定波長(zhǎng)：340nm；反應(yīng)溫度：37℃。

尿素的測(cè)定采用尿素試劑盒，其他測(cè)定條件同氨。

1.4.4定標(biāo)

取1mL超純水、1mL含尿素50mg/L的定標(biāo)液置于樣品架上，按儀器設(shè)定參數(shù)定標(biāo)，定標(biāo)類型：線性；重復(fù)時(shí)間：1天；定標(biāo)各點(diǎn)重測(cè)次數(shù)：2次。

1.4.5樣品測(cè)定

取待測(cè)樣品1mL，置于樣品架各個(gè)樣品位上，按照儀器的使用規(guī)程和參數(shù)設(shè)定進(jìn)行檢測(cè)，自動(dòng)計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨對(duì)尿素測(cè)定的干擾

脲酶-谷氨酸脫氫酶法的原理是尿素在酶的作用下分解產(chǎn)生的氨，Iiday[23]研究報(bào)道黃酒及黃酒發(fā)酵液內(nèi)源氨含量是尿素含量的6～10倍，會(huì)對(duì)尿素的測(cè)定有干擾，本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃酒中氨含量對(duì)尿素的測(cè)定干擾情況進(jìn)行了研究。固定尿素的含量，分別配制氨濃度為尿素濃度的1、2、6、10、12、15倍的混合溶液，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，從圖1可以看出，當(dāng)氨濃度是尿素濃度的6倍時(shí)(C氨/C尿素=6)，尿素的回收率為119%，當(dāng)氨濃度是尿素濃度的10倍時(shí)(C氨/C尿素=10)，尿素的回收率超過(guò)140%以上，隨著C氨/C尿素比值增加，尿素的回收率增加，而氨根離子的回收率基本都在100%左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)氨濃度超過(guò)尿素濃度的6倍以上對(duì)尿素的測(cè)定產(chǎn)生正干擾，本研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，因此，采用脲酶-谷氨酸脫氫酶法測(cè)定黃酒中尿素需要首先除去黃酒中高含量的游離態(tài)的氨根離子。

圖1 氨對(duì)尿素測(cè)定的干擾研究

2.2 前處理方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)離子交換樹(shù)脂種類、洗脫液種類、洗脫液體積和洗脫液pH值等條件進(jìn)行了選擇和優(yōu)化。

2.2.1陽(yáng)離子交換樹(shù)脂類型比較

采用6 mg/L的尿素標(biāo)準(zhǔn)品(含60 mg/L氨)，按照1.4實(shí)驗(yàn)方法比較001×1、001×7、001×14.5.3種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的除氨效果，001×7和001×14.5 兩種樹(shù)脂的氨除去率均為100 %，但尿素回收率分別為68.14 %和17.35 %，均偏低，說(shuō)明對(duì)尿素有一定吸附；001×1樹(shù)脂的氨除去率為89.29 %，尿素回收率為96.78 %，該樹(shù)脂除氨效果理想且對(duì)尿素影響較小,結(jié)果見(jiàn)圖2樣品前處理方法優(yōu)化(A)，因此本方法最終選擇001×1強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。

2.2.2洗脫液的選擇

尿素易溶于水，可溶于乙醇，甲醇等有機(jī)溶劑，在酸性、堿性以及加熱條件下水解。選擇尿素的洗脫液優(yōu)先考慮水，本實(shí)驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)方法采用純水、50 %乙醇、80 %乙醇和90 %乙醇4種洗脫液，根據(jù)黃酒中尿素的加標(biāo)回收率比較洗脫液的效果，從圖2樣品前處理方法優(yōu)化(B)中可見(jiàn)純水洗脫液效果最佳。

2.2.3洗脫液體積的選擇

采用5、8、10、15 mL不同體積的二次蒸餾水分別為洗脫液，對(duì)10 mg/L尿素加標(biāo)酒樣做回收率實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明洗脫體積為5mL時(shí)尿素未完全洗脫，洗脫體積為10 mL時(shí)，可以滿足洗脫需要，繼續(xù)增大洗脫液體積，回收率沒(méi)有明顯變化，確定洗脫劑用量為10 mL,見(jiàn)圖2樣品前處理方法優(yōu)化(C)。

2.2.4洗脫液pH的比較

黃酒的pH在3～4之間，氨在酒樣中以離子形式存在，用pH3.5、pH5.5、pH 7.5、pH 8.5水洗脫液對(duì)10 mg/L加標(biāo)黃酒樣進(jìn)行洗脫，通過(guò)回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定洗脫效果，從圖2樣品前處理方法優(yōu)化(D)可以看出用二次蒸餾水(pH5.5)即可滿足測(cè)定要求。

圖2 樣品前處理方法優(yōu)化

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍和檢出限

配制系列2.0、5.0，10、25.0、50.0 mg/L的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照Arena 20 XT 儀器設(shè)定的條件進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)定響應(yīng)值(y)對(duì)濃度(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算線性回歸方程，尿素在2.0～50.0mg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999，見(jiàn)表1。用Arena 20 XT 儀器測(cè)定尿素空白溶液20次，按照AOAC推薦的方法[24]，計(jì)算得本方法對(duì)尿素的檢出限為0.47 mg/L和定量限為2.23mg/L見(jiàn)表1。

表1 線性范圍、檢出限

2.3.2方法的加標(biāo)回收率

分別向成品黃酒和黃酒生產(chǎn)過(guò)程發(fā)酵液中加入高、中、低3個(gè)不同濃度梯度的尿素標(biāo)準(zhǔn)液，按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定并計(jì)算回收率，成品黃酒的回收率在101.3 %～107.4 %之間，黃酒生產(chǎn)過(guò)程發(fā)酵液的回收率在100.3 %～109.1 %之間，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 脲酶-谷氨酸脫氫酶法測(cè)定黃酒及黃酒生產(chǎn)過(guò)程發(fā)酵液中尿素的加標(biāo)回收率(n=3)

2.3.3方法的精密度

對(duì)同一樣品取10份按本方法分別測(cè)定，計(jì)算成品黃酒和黃酒過(guò)程樣的重復(fù)性RSD%,分別為2.62%和3.51%；結(jié)果分別見(jiàn)表3。

表3 尿酶法對(duì)葡萄酒中尿素含量的精密度測(cè)定結(jié)果(n=10)

2.4 脲酶-谷氨酸脫氫酶法與液相色譜法測(cè)定尿素的結(jié)果比較

分別用本實(shí)驗(yàn)方法脲酶-谷氨酸脫氫酶(Urease-GLDH)和QB/T 4710—2014，發(fā)酵酒中尿素測(cè)定方法高效液相色譜法[17]兩種方法處理并測(cè)定黃酒成品酒和黃酒生產(chǎn)過(guò)程發(fā)酵液中尿素含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Urease-GLDH和HPLC-FLD法對(duì)黃酒及黃酒生產(chǎn)過(guò)程發(fā)酵液中尿素測(cè)定結(jié)果的比較

對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(表5)，P0.05=0.891>0.5；F=0.1980.5。以上分析說(shuō)明兩種方法測(cè)定無(wú)顯著性差異，經(jīng)與QB/T 4710-2014 HPLC-FLD法對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，Urease-GLDH法檢測(cè)黃酒及黃酒發(fā)酵液中的尿素具有較高準(zhǔn)確性。將國(guó)標(biāo)HPLC-FLD和Urease-GLDH兩種方法的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行對(duì)比(表7)，可以得到：

表5 兩種方法測(cè)定結(jié)果方差分析

表6 兩種方法測(cè)定結(jié)果T檢驗(yàn)表

表7 Urease-GLDH法與HPLC-FLD法對(duì)比結(jié)果

(1)HPLC-FLD和Urease-GLDH兩種方法都具有良好的回收率、精密度和重復(fù)性，可滿足黃酒生產(chǎn)過(guò)程尿素監(jiān)控的要求，且Urease-GLDH成本更低，操作簡(jiǎn)單，所用試劑基本無(wú)毒無(wú)害；

(2)HPLC-FLD相對(duì)Urease-GLDH法具有較高的靈敏度，而Urease-GLDH法測(cè)定黃酒樣所需平均時(shí)間17min,測(cè)定速度較HPLC法提高近4倍，黃酒生產(chǎn)過(guò)程中尿素含量處于不斷變化的狀態(tài)，因此從快速監(jiān)控的角度考慮，Urease-GLDH法更適合于黃酒生產(chǎn)過(guò)程發(fā)酵液中尿素的快速測(cè)定。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)除去黃酒中內(nèi)源性的氨根離子的前處理方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究，對(duì)比不同離子交換樹(shù)脂除氨的效果、選擇了強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，并對(duì)洗脫液種類、體積和pH值等主要影響因素進(jìn)行了選擇優(yōu)化，研制的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂可除去黃酒中近90 %的氨，消除氨對(duì)尿素測(cè)定的影響，實(shí)現(xiàn)了酶法快速測(cè)定黃酒及黃酒生產(chǎn)過(guò)程發(fā)酵液中尿素，本方法前處理簡(jiǎn)單，方法易于掌握，且不需使用乙腈等有機(jī)化學(xué)溶劑，與液相色譜法相比，測(cè)定效率提高近4倍，可供釀酒企業(yè)進(jìn)行黃酒產(chǎn)品及生產(chǎn)過(guò)程中尿素的快速監(jiān)控，為開(kāi)展黃酒中質(zhì)量安全過(guò)程監(jiān)控提供一種快速的分析測(cè)試方法。