能力驗證樣品中玉米赤霉烯酮含量測定的不確定度評定

陸春勝 馬 莉 陳云忠

(上海市崇明食品藥品檢驗所，上海 202150)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，以下簡稱ZEA)是由以禾谷鐮刀菌和三線鐮刀菌為主的鐮刀菌產生的一種次級代謝產物，廣泛存在于玉米、小麥等谷物中，可對人和動物健康產生嚴重影響。其主要特點是具有類雌激素樣作用，對雌性動物的生殖系統損害極大，文獻報道其還能導致免疫抑制、肝腎損傷、具有潛在的致癌性[1-3]。目前可以使用高效液相色譜、氣相色譜、酶聯免疫、薄層色譜、酶聯免疫和生物傳感器等方法進行檢測[45]。

能力驗證是實驗室質量控制的主要手段之一，通過參加能力驗證可以綜合考察實驗室的質量運行是否可靠，同時可以識別實驗室存在的問題，制定相應的預防和糾正措施[5]。本實驗室參加中國檢驗檢疫測試研究院測試評價中心組織的玉米油中玉米赤霉烯酮能力驗證，通過回收率t檢驗，對測量結果進行了修正，并給出了報告結果的測量不確定度。本研究建立了ZEA測量不確定度的評定方法，以期為實驗室日常質量控制提供參考[6-9]。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與材料

1260 高效液相色譜配有熒光檢測器(美國 Agilent Technology 公司)；ST 8R 冷凍離心機、REACTI-THERMⅢ 氮吹儀(美國 Thermo Fisher 公司)；MS205DU 十萬分之一電子天平、PL2002百分之一電子天平(瑞士 METTLER TOLEDO 公司)；ULTRA TURRAX 高速勻漿機(德國 IKA 公司)。

乙腈、甲醇(HPLC，德國 CNW 公司)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、吐溫-20、鹽酸(AR，國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為Thermo Fisher GEN PURE PRO 制備的超純水。

玉米赤霉烯酮標準品(98.0%，加拿大 TRC 公司)；玉米赤霉烯酮免疫親和柱(3 mL，美國Beacon公司)。

試驗用玉米油樣品為中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供的能力驗證樣品，能力驗證計劃編號為ACAS-PT834，樣品編號分別為19-F935、19-G210；空白玉米油為市售。

1.2 試驗方法

1.2.1標準溶液配制

精密稱取5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，得最終濃度為100 μg/mL的標準儲備液。

標準系列溶液配制：分別準確吸取100 μg/mL 的標準儲備液0.03、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 mL，用乙腈-水-甲醇(46∶46∶8，V/V)定容至100 mL，配制成質量濃度為30.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0和300.0 ng/mL的標準系列溶液。

1.2.2樣品處理

本方法采用GB 5009.209—2016 《食品安全國家標準 食品中玉米烯酮的測定》中第一法 高效液相色譜法測定樣品中ZEA的含量[5]，具體測定步驟見圖1。

圖1 玉米油中玉米赤霉烯酮含量測定步驟

樣本加標：稱取空白玉米油樣品40.0 g，加入100 μg/mL的標準儲備液0.10 mL，混勻，余同圖1樣品處理過程。

1.2.4色譜條件

色譜柱：Agilent XDB C18 1.8 μm 0.3×10 cm；流動相：乙腈-水-甲醇(46∶46∶8，V/V)；流速：0.6 mL/min；檢測波長：激發波長274nm，發射波長440 nm；進樣量：10 μL；柱溫：35℃。

1.2.5數學模型的建立

根據玉米油中ZEA的測定原理和方法，ZEA含量的計算公式為：

式中：X試樣中ZEA的含量，μg/kg；C測定試樣中ZEA的含量，ng/mL；V測定試樣的最終定容體積，mL；m試樣的稱樣量，g；1000 單位換算系數；f稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

從測量過程和數學模型分析，樣品中ZEA測定不確定來源主要有：標準溶液、標準曲線擬合、樣品稱樣、處理過程和測量重復性等。不確定度來源因果關系見圖2。

圖2 不確定度來源因果關系

2.2 配制標準儲備液和標準系列溶液引入的相對不確定度urel(C)

配制標準儲備液和標準系列溶液引入的不確定度主要有以下幾個分項構成[10-14]：ZEA標準品本身引入的不確定度urel(C1)；稱量標準品引入的不確定度urel(C2)；50mL容量瓶定容引入的不確定度urel(C3)；30～300μL可調移液器移液引入的不確定度urel(C4)；100 mL容量瓶定容引入的不確定度urel(C5)。

2.2.1標準物質本身引入的不確定度urel(C1)

ZEA標準物質證書顯示，純度為98.0%，相對擴展不確定度為2.0%(k=2)，引入的不確定度為u(C1)=2.0%/2=1.0%，其相對不確定度為urel(C1)=(1.0%/98.0%)×100%=1.020%。

2.2.2標準物質稱量引入的不確定度urel(C2)

2.2.3標準物質溶解定容引入的不確定度urel(C3)

2.2.4標準系列溶液移液引入的不確定度urel(C4)

2.2.5標準系列溶液定容引入的不確定度urel(C5)

2.2.6合成urel(C)

=1.227%

2.3 樣品稱樣引入的相對不確定度urel(m)

2.4 待測樣品處理稀釋引入的相對不確定度urel(f)

根據方法，實驗中共用到100 mL單標線吸管1次，10 mL單標線吸管2次，50 mL容量瓶1次，證書顯示100 mL單標線吸管MPE為0.08 mL，10 mL單標線吸管MPE為0.02 mL，50 mL容量瓶MPE為0.05 mL，均取矩形分布。乙腈和水的膨脹系數分別為1.37×10-3mL/℃和2.1×10-4mL/℃，設實驗室溫度變化為4℃。

按照2.2.3的計算方法，分別算得其相對不確定度urel(f1)=0.320%，urel(f2)=0.337%，urel(f3)=0.076%，urel(f4)=0.126%。

由樣品稀釋處理引入的相對不確定度：

=0.487%

2.5 待測樣品復溶引入的相對不確定度urel(V)

根據方法，用1000 μL可調移液器定量加入1.0 mL流動相溶解殘渣，證書顯示其擴展不確定度為0.53 μL(k=2)，引入的不確定度為u(V)=0.53/2=0.265 μL，其相對不確定為urel(V)=(0.265/1000)×100%=0.026%。

2.6 標準曲線擬合引入的相對不確定度urel(Cpred)

配制的標準系列溶液及待測樣品溶液重復進樣2次，以標準溶液濃度(ng/mL)為橫坐標，以峰面積值為縱坐標，采用最小二乘法擬合標準曲線。標準系列溶液濃度及其對應的峰面積、校準曲線及相關系數見表1，被測樣品測得數據見表2。

表1 標準曲線數據

表2 被測樣品測得數據

采用最小二乘法擬合引入的測量不確定度u(Cpred)采用如下公式計算[15-19]：

式中：u(Cpred)標準曲線擬合引入的不確定度，ng/mL；S標準曲線的擬合標準偏差，ng/mL；B1標準曲線斜率；p對樣品溶液的測定次數，本實驗平行測定2次；n標準溶液的測試次數，本實驗中對7個標準溶液各重復測定2次，n=7×2=14；Cpred測試樣品濃度，ng/mL；C系列標準溶液的平均濃度，ng/mL；Ai標準溶液峰面積；Ci標準溶液濃度，ng/mL；B0標準曲線截距。

將表1、表2數據分別帶入上述公式，得19-F935樣品u(Cpred)=1.46617 ng/mL，其相對不確定度為urel(Cpred)=1.46617/217.35399×100%=0.675%；得19-G210樣品u(Cpred)=1.48139 ng/mL，其相對不確定度為urel(Cpred)=1.48139/87.06576×100%=1.702%。

2.7 重復測定引入的相對不確定度urel(rep)

取6份1.2.2中的空白加標樣品，按方法處理后進樣測定，測得ZEA加標含量及回收率見表3。

表3 玉米赤霉烯酮加標含量及回收率表

2.8 合成相對擴展不確定度Urel(X)

對各不確定度分量進行匯總，結果見表4。

表4 不確定度分量匯總表

樣品中ZEA含量測定的相對不確定度urel(X)按下式計算：

將數據代入上式，19-F935樣品的urel(X)為1.495%，19-G210樣品的urel(X)為2.162%。樣品中ZEA含量測定的合成擴展相對不確定度Urel(X)按下式計算：

Urel(X)=k×urel(X)

k取2(包含概率為95%)，代入計算得19-F935樣品的相對擴展不確定度Urel(X)為3.0%，19-G210樣品的相對擴展不確定度Urel(X)為4.4%。

2.9 結果報告

其中urel(Vadd)為加標用30～300 μL可調移液器的相對不確定度，加標樣共使用6次。

表5 結果報告及能力驗證參考值

3 結論

采用回收率不確定度來檢驗回收率結果是否應用于結果的修正，結果表明實驗測得值需進行回收率修正。修正后報告結果252.7 μg/kgU=3.0%(k=2)和100.8 μg/kgU=4.4%(k=2)，能力驗證結果為滿意。

通過不確定度評定分析，本法中樣品稱樣、樣品定容和樣品重復測量引入的不確定度影響均較小，在實際計算時可以忽略不計；標準物質配制及標準曲線擬合是主要的不確定度來源；本法預處理過程復雜，樣品處理過程中引入的不確定度不可忽略。因此，實驗室應選擇不確定度較小的有證標準物質；在設計實驗時，應設置合理的標準曲線范圍、增加平行樣品測定、確保HPLC系統穩定性，以減小曲線擬合時引入的不確定度；實驗員應規范操作，在樣品過柱洗脫及氮吹時注意樣品損失，避免在復雜的樣品處理過程中將不確定度放大，從而提高檢測質量。