QuEChERS法萃取-氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)大蔥等鱗莖類蔬菜中6種殺菌劑的分析方法

劉建平 駱 洪 連海飛 崔 艷 聶 晶

(內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院資源環(huán)境與檢測(cè)技術(shù)研究所，呼和浩特 010031)

鱗莖類蔬菜，又稱蔥蒜類蔬菜，如大蔥、大蒜、洋蔥等，具有特殊的辛、辣氣味，是我們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚牟穗龋彩抢习傩障矏?ài)的蔬菜之一[1，2]，該類蔬菜不但可以生食、也可以做菜，使用方法諸多，是秋冬之際北方地區(qū)主要的蔬菜品種，如大蔥在我國(guó)種植面積較為廣泛，約占全世界總產(chǎn)量的25%左右，僅2017年上半年，我國(guó)出口大蔥量約為3.27萬(wàn)噸[3-5]；目前，我國(guó)大蔥播種模式主要采用畦上播種和溝內(nèi)播種，在種植過(guò)程中，大蔥等鱗莖類蔬菜易受到紫斑病、蔥銹病、菌核病、蔥薊馬、種蠅等病蟲害的影響，因此在種植栽培時(shí)，常施用殺菌劑和殺蟲劑用于防治病蟲害，如百菌清可濕性粉劑等防治紫斑病、粉銹寧可濕性粉劑等防治蔥銹病等[6-8]；人、畜類誤食用被殺菌劑或殺蟲劑污染的大蔥等鱗莖類蔬菜時(shí)，會(huì)導(dǎo)致痙攣、頭暈等，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致死亡，如2017年8月山東壽光“毒大蔥”事件[9，10]。因此，加強(qiáng)對(duì)大蔥等鱗莖類蔬菜中百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯等農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)，保障人們飲食安全，具有重要的意義。QUECHERS提取法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的農(nóng)藥檢測(cè)前處理方法，相比較其他方法，具有試劑用量少、操作簡(jiǎn)單、速度快等特點(diǎn)[11-15]，本實(shí)驗(yàn)建立了QUECHERS法提取大蔥等鱗莖類蔬菜中百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯農(nóng)藥氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)的分析方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：安捷倫7890B型氣相色譜儀，配備安捷倫7000C型質(zhì)譜檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱等(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；電子分析天平：mettler-Toledo XP 105DR型，規(guī)格：十萬(wàn)分之一(瑞士梅特勒托利多科技有限公司)；石英毛細(xì)管色譜柱：Agilent HP-5MS型質(zhì)譜專用柱，規(guī)格：30m×0.25 mm，0.25μm(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；水浴氮?dú)獯蹈蓛x：DCY-36YD型(上海那艾儀器科技有限公司)；超聲波清洗機(jī)：KQ-500TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗器(上海星堯科學(xué)儀器有限公司)；超純水凈化系統(tǒng)：Milli-Q A10型(美國(guó)密理博科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)溶液：內(nèi)標(biāo)100μg/mL環(huán)氧七氯標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB-05-2317-2016)，100μg/mL百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)082524)，100μg/mL菌核凈標(biāo)準(zhǔn)溶液(1ST21015-100M)，100μg/mL粉銹寧標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)082676)，100μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)083007)，100μg/mL異菌脲標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)082520)，100μg/mL溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)081176)，均購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

試劑耗材：甲醇、丙酮、乙腈、環(huán)己烷均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水：純化水，純水儀制；C18、N-丙基乙二胺(PSA)，購(gòu)自天津博納艾杰爾科技公司；凈化包(1g MgSO4, 500mg PSA和500mg C18)，購(gòu)自浙江合譜試劑公司。

1.3 溶液配制

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：精密移取1.0mL100μg/mL環(huán)氧七氯置于容量瓶中，用丙酮定容搖勻，環(huán)氧七氯質(zhì)量濃度為10μg/mL)。

標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液：精密移取100μg/mL濃度的百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)液各1.00mL，置于10mL容量瓶中，加少量丙酮溶解，再用丙酮定容搖勻，百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯質(zhì)量濃度為10μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液一定量，加丙酮制備含百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯質(zhì)量濃度分別為0.04、0.10、0.50、2.00、4.00、10.0μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)加入10μg/mL環(huán)氧七氯溶液50uL，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

樣品溶液：取鱗莖類蔬菜(以大蔥為例)約500 g，切成3cm長(zhǎng)小段，置粉碎機(jī)中粉碎，粉碎后的樣品置密封袋中，冷凍保存；準(zhǔn)確稱取樣品10.0 g，置塑料離心管中，加丙酮-環(huán)己烷(V∶V=1∶1)溶液20mL，再加入1.0 g乙酸鈉和4.0 g MgSO4(QuEChERS萃取包)，渦旋提取3.0 min后，冷凍離心10 min(12000 r/min)；將離心后的萃取液轉(zhuǎn)移至QuEChERS凈化管中(400mg PSA，1.2g MgSO4，400mg GCB和400mg C18)，渦旋混合2.0 min后，冷凍離心10 min(12000 r/min)；取上清液10mL，置氮吹儀上氮吹至近干，殘?jiān)蛹尤?0μg/mL環(huán)氧七氯溶液50uL，丙酮定容1.0mL，渦旋1min，0.45μm濾膜濾過(guò)，即得。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

色譜參數(shù)：色譜柱：Agilent HP-5MS(30m×0.25 mm，0.25μm)；載氣：氦氣(純度：99.9999%)；進(jìn)樣口溫度: 230℃；碰撞氣：氬氣(純度：99.9999%)；柱流量：1.28 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣體積：1μL；升溫方式：程序升溫。升溫程序見(jiàn)表1。

表1 升溫條件

質(zhì)譜參數(shù)：開(kāi)啟質(zhì)譜儀，過(guò)夜抽真空，用全氟三丁胺自動(dòng)調(diào)諧儀器至最佳檢測(cè)條件。調(diào)諧后質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜儀參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

現(xiàn)階段，用于蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法主要有：凝膠凈化色譜法、自動(dòng)固相萃取法和QuEChERS提取法等方法。凝膠凈化色譜法采用過(guò)凝膠柱方式凈化待測(cè)樣品，提取效果好，但試劑用量較大，且儀器價(jià)格昂貴，方法適用性較差；全自動(dòng)固相萃取法采用固相萃取裝置凈化、富集、洗脫待測(cè)樣品，操作步驟繁瑣，檢測(cè)準(zhǔn)確度偏低；QuEChERS提取法是近階段發(fā)展起來(lái)的前處理方法，具有試劑用量少、提取速度快、步驟簡(jiǎn)單、檢測(cè)準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較上述3種前處理方法，對(duì)加標(biāo)樣品(加標(biāo)終點(diǎn)濃度：0.1 μg/mL)進(jìn)行提取，考察3種前處理方法檢測(cè)準(zhǔn)確性。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3種前處理方法比較

2.2 質(zhì)譜方法(MRM)的優(yōu)化

三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀定量檢測(cè)模式有兩種：全掃描模式(SCAN)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。如果采用全掃描模式，則離子響應(yīng)值較低，不適用鱗莖類蔬菜中極微量農(nóng)藥殘留的檢測(cè)；MRM方法采用離子監(jiān)測(cè)方式，可以大大提高離子響應(yīng)值，更適用于極微量農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)，但MRM方法需要進(jìn)行優(yōu)化后才可達(dá)到預(yù)期效果。實(shí)驗(yàn)配制濃度為5 μg/mL的百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀1 μL，采用SCAN模式，找到目標(biāo)化合物的母離子；再采用碎片離子掃描模式，將母離子擊碎，找到母離子對(duì)應(yīng)的子離子；選擇響應(yīng)強(qiáng)度較高的3個(gè)子離子，其中1個(gè)作為定量離子，2個(gè)作為定性離子；根據(jù)選擇的離子對(duì)，進(jìn)行碰撞能量和碰撞電壓的優(yōu)化，建立百菌清MRM方法；同法建立菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯的MRM方法。離子對(duì)選擇見(jiàn)表4, 6種農(nóng)藥典型的標(biāo)準(zhǔn)譜圖見(jiàn)圖1。

表4 6種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 6種農(nóng)藥的典型標(biāo)準(zhǔn)譜圖

2.3 內(nèi)標(biāo)法消除干擾

三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法采用離子對(duì)監(jiān)測(cè)的方式進(jìn)行，雖然專屬性較好，但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，常時(shí)常受到環(huán)境溫度等因素變化，導(dǎo)致待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥信號(hào)值發(fā)生漂移；且鱗莖類蔬菜大多具有辛、辣氣味，含有揮發(fā)性物質(zhì)較多，基質(zhì)較為復(fù)雜，待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥可能會(huì)受到基質(zhì)干擾導(dǎo)致信號(hào)增強(qiáng)或抑制。為消除上述干擾，提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法，即在標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)物環(huán)氧七氯，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法校正待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥，提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)比較外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法對(duì)待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥準(zhǔn)確度的影響，證明內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確度更高。因此實(shí)驗(yàn)選擇內(nèi)標(biāo)法作為定量方法。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限

取1.3溶液配制項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別精密移取一定量，加丙酮制備含百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯質(zhì)量濃度分別為0.04、0.10、0.50、2.00、4.00、10.0μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；再按1.4實(shí)驗(yàn)方法項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件設(shè)置儀器，上述溶液分別取1 μL注入色譜儀，以待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)應(yīng)響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再以3倍信號(hào)和噪音的比值計(jì)算檢出限。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 6種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 方法重復(fù)性試驗(yàn)

選取空白鱗莖類蔬菜(以大蔥為例)，加入1.3溶液配制項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液一定量，制備添加6種待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥終點(diǎn)濃度0.1 μg/mL的加標(biāo)溶液，同法平行配制6份，再按1.4實(shí)驗(yàn)方法項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件設(shè)置儀器，上述溶液分別取1 μL注入色譜儀，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算重復(fù)性RSD。結(jié)果百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯重復(fù)性RSD分別為3.18%、2.79%、4.12%、3.57%、4.61%和3.94%，6種待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥重復(fù)性RSD均不高于5.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

選取空白鱗莖類蔬菜(以大蔥為例)，分別加入1.3溶液配制項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液一定量，制備3個(gè)濃度水平(終點(diǎn)濃度：0.02μg/mL、0.20μg/mL和2.0μg/mL)添加6種待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥的加標(biāo)溶液，每個(gè)濃度水平添加3份，再按1.4實(shí)驗(yàn)方法項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件設(shè)置儀器，上述溶液分別取1 μL注入色譜儀，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果和實(shí)際添加量計(jì)算回收率試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯平均加標(biāo)回收率在84.2～104.2%之間。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果 %

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

隨機(jī)購(gòu)買市售大蔥、大蒜、洋蔥樣品，按1.3溶液配制項(xiàng)下樣品溶液制備方法進(jìn)行前處理，得樣品溶液，再按1.4實(shí)驗(yàn)方法項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件設(shè)置儀器，上述樣品溶液分別取1 μL注入色譜儀，采集色譜圖，計(jì)算樣品中百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯的含量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 方法應(yīng)用實(shí)例

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了QUECHERS法提取大蔥等鱗莖類蔬菜中百菌清、菌核凈、粉銹寧、甲霜靈、異菌脲和溴氰菊酯農(nóng)藥氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)的分析方法，此方法具有快速、靈敏和準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，且線性關(guān)系良好，平均加標(biāo)回收率在84.2～104.2%之間，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5.0%以內(nèi)，與其他農(nóng)藥殘留方法相比較，具有試劑用量少、效率高等特點(diǎn)，可以用于大蔥等鱗莖類蔬菜中常用農(nóng)藥的檢測(cè)。