流感病毒檢驗及相關方法的研究進展

天津市海河醫(yī)院（300350）秦中華

流感具有較高發(fā)病率及死亡率，在各個國家均有不同程度的發(fā)生率，導致急性呼吸道感染的主要病原之一，其屬于正黏病毒科，是有包膜以及分階段的單股負鏈RNA病毒[1]。目前流行病毒主要分為甲型及乙型，甲型流感病毒抗原變異較為活躍，對世界范圍具有一定影響；乙型流感病毒感染及傳播能力較甲型弱，但也會引起一定程度暴發(fā)流行。我國是流感病毒高發(fā)區(qū)，近年來，流感發(fā)生率不斷升高，直接威脅人類生命健康[2][3]。因此，臨床需尋求快速、準確且適用于臨床應用的流感病毒診斷方式，以早期診斷、隔離及治療。研究顯示，流感病毒檢驗方式較多，但目前臨床對其研究并不多見，為此，本文旨在對國內外流感病毒檢驗相關方法進行綜述，為臨床診斷提供思路。現(xiàn)綜述如下。

1 病毒分離鑒定

病毒分離法是一種檢測流感病毒的傳統(tǒng)方式，雖然具有敏感性高且精確度高等優(yōu)點，且可在一定程度上檢測出病毒毒株情況，但是也具有一定局限，如檢測周期較長，具有一定安全隱患，故不適宜大規(guī)模應用[4]。研究學者表明，在細菌培養(yǎng)后常常通過免疫熒光技術進行進一步鑒定，排除其他病毒可能性后，檢測甲型流感病毒核蛋白，做出診斷。王林等[5]研究選取流感高峰季節(jié)收集流感哨點醫(yī)院流感病例標本（ILI）1025份，采用犬腎傳代細菌培養(yǎng)及實時熒光定量檢測，對比兩種方式檢驗差異情況；研究結果顯示，在選取病例中，實時熒光定量檢測流感病毒核酸陽性率為26.63%，細胞培養(yǎng)檢出12.58%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在273份陽性標本中，分離出118株病毒株，占43.22%，752例陰性標本中，分離出11株病毒株，占1.46%，實時熒光定量法檢驗陽性標本及陰性標本分離率差異顯著。根據(jù)其研究可發(fā)現(xiàn)，實時熒光定量檢測速度較快，靈敏性高，適用于臨床檢測及診斷流感疫情；細胞培養(yǎng)能夠獲得毒株，可進行基因特異性及耐藥性等深入研究，二者結合診斷效果更佳。

2 免疫學檢測

2.1 酶聯(lián)免疫吸附實驗 免疫學檢測也是檢測流感病毒常用方式之一，其主要依據(jù)抗原抗體反應進行檢驗，一般需要對血清中的抗原或者抗體進行檢測。其中酶聯(lián)免疫吸附法可用于檢測抗原或抗體，具有方便快捷、靈敏度及特異度高等優(yōu)點，是當前臨床較為常用的免疫測定方式之一[6]。章倩云等[7]針對禽流感病毒M基因、H7基因以及N9基因的基因片段保守序列，進行特異性標記后，通過酶聯(lián)免疫吸附法對PCR擴增情況進行判斷；研究結果顯示，其檢測三個基因片段最低拷貝數(shù)敏感性高于普通PCR技術的10～100倍；此外，在不同流感病毒亞型間，不同病毒之間均不存在交叉反應現(xiàn)象；通過對臨床114份標本進行檢測發(fā)現(xiàn)，結果與雞胚培養(yǎng)符合率達到100%。根據(jù)其研究結果可發(fā)現(xiàn)，酶聯(lián)免疫吸附法操作簡單，具有較高靈敏度及特異度，可廣泛應用于流感病毒實驗室檢測。

2.2 免疫熒光技術 免疫熒光技術具有檢測結果直觀等優(yōu)點，但是其仍具有一定局限，如對制備抗原具有較高要求，可能會產生非特異性染色體[8]。何潔靜等[9]研究運用雙抗夾心建立柯薩奇病毒A16型的時間分辨免疫熒光技術，對該種方法檢測的靈敏度及特異度等進行分析；研究結果顯示，時間分辨免疫熒光技術的檢驗，靈敏度為0.02ng/ml，回收率為100.2%～101.5%之間，將其與金標準PCR技術相比，檢測結果的相關性較酶聯(lián)免疫吸附法高。根據(jù)其研究結果可知，時間分辨免疫熒光法具有操作簡單、靈敏度及準確度高等優(yōu)點，適用于臨床篩查柯薩奇病毒A16型。

2.3 膠體金免疫標記法 既往相關研究報道，通過膠體金可有效檢測人絨毛膜的促性腺激素，這也成為臨床免疫學研究的重點及熱點，受到臨床醫(yī)學界及研究界廣泛關注[10]。多年前，相關研究學者開始申請有關膠體金快速檢測試紙相關專利，近年來，不少研究學者采用膠體金免疫法檢測流感病毒，并取得一定研究結論。如鄭嘉庚等[11]學者為建立一種快速定性檢測血清丙型肝炎病毒（HCV）抗體方式，其根據(jù)雙抗原夾心法實驗原理，建立膠體金免疫層分析法對人體血清中丙型肝炎抗體進行檢測；研究結果顯示，陰性參考品及陽性參考品符合率達到100%，平行測定10條重復性參考品，全部顯示陽性；通過檢測血清1050份標本發(fā)現(xiàn)，其與酶聯(lián)免疫吸附法符合率高達96.9%；又經檢測發(fā)現(xiàn)，該方法檢測靈敏度（97.90%）、特異度（99.00%）均較高。根據(jù)其研究可見，膠體金免疫標記法是一種更加方便、快速檢測血清中HCV抗體方式，可為臨床診治提供重要參考價值。

3 流感病毒的核酸檢測

3.1 聚合酶鏈反應 聚合酶鏈反應（PCR）是一項可在較短時間內大量擴增DNA片段的分子生物學技術，具有敏感性、特異性高等特點，可在較短時間內對流感病毒進行檢測，對早期診斷流感病毒感染具有較高價值[12]。研究顯示，PCR技術用于病原體的確定，可有效檢測出早期感染患者，與病毒分離法比，其敏感性強500倍，但一般的PCR技術具有一定污染。蔡航航等[13]為了對比免疫組化法與PCR技術對EB病毒潛伏膜蛋白1（LMP-1）的檢測價值，其選取50例鼻咽癌患者以及50例鼻咽炎患者進行分析對比，分別對不同患者標本采用免疫組化法及PCR技術進行檢測；研究結果顯示，與免疫組化法比，PCR技術檢測LKP-1的靈敏度、準確度均較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩種方式診斷特異度無差異。根據(jù)該研究結果可知，PCR用于檢測LMP-1具有較高診斷準確度及靈敏度，用于臨床具有更高價值。

3.2 環(huán)介導等溫擴增試驗（LAMP） LAMP是一種DNA環(huán)介導的等溫核酸擴增方法，目前被臨床廣泛應用于檢測多種病毒。目前的基因特異性擴增可通過光度法檢測反應結束時溶液中所釋放的相關副產物。研究顯示，LAMP靈敏度與PCR相似，已被臨床廣泛應用于檢測流感病毒。如趙娜等[14]應用LAMP技術檢測乙型肝炎病毒，通過檢測乙型肝炎病毒毒株以及臨床樣本，評價LAMP的靈敏度、特異度以及抗干擾性，并將研究結果與PCR進行對比；研究顯示，LAMP技術特異性高，未產生非特異性擴增；煮沸法的LAMP與PCR技術具有較好一致性。根據(jù)該研究學者結果可發(fā)現(xiàn)，LAMP技術在檢測乙型肝炎病毒中具有一定優(yōu)點，通過該方式檢測有利于提高臨床檢出率，為早期診治提供重要參考價值。此外，基因芯片法也是核酸檢測方式之一，可對數(shù)萬個基因進行檢測，該種方式通過在支持物上固定大量探針分子，將其與標記的樣本分子進行雜交，進而通過所獲得信號強度，對樣本相關數(shù)量及序列相關信息進行分析。研究發(fā)現(xiàn)，該種方式具有較高靈敏度及特異度，但其對實驗條件要求較高，價格昂貴，不方便一般檢測。

4 小結與展望

流感是分布于全球的感染性疾病，不僅對人類生命健康造成嚴重威脅，也給國家經濟發(fā)展及社會穩(wěn)定造成一定威脅，故尋求安全可靠的流感病毒檢測方式成為臨床研究重點。病毒分離鑒定是檢測流感病毒傳統(tǒng)方式，其可有效檢測出病毒毒株，具有精確度高等優(yōu)點，但是其具有一定局限性，如操作較為復雜，等待時間長，很難被臨床推廣。核酸檢測法是一種有效檢測流感病毒方法，與傳統(tǒng)方式比，其可在短時間內完成檢測，但是其也具有一定局限性，如對檢測技術人員要求較高，且價格昂貴，應用不多。免疫學檢測操作簡單，對檢驗人員要求不高，特別是膠體金免疫標記法所需時間更短，可現(xiàn)場檢測，較為方便；其中酶聯(lián)免疫吸附法具有檢驗迅速、靈敏度高且可定量等優(yōu)點，被臨床廣泛應用。因此，臨床需結合不同地區(qū)對流感病毒檢測要求，選擇適宜的檢測方法及設備，提高診斷準確率。