甲基營養型芽孢桿菌BMF 04菌株的抑菌譜及對仁果類真菌病害的防治作用

萬丹丹，吳海霞，湯曼麗，彭 云，陳 茹，馬桂珍，暴增海*

（1.江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇連云港222000；2.南京醫科大學康達學院，江蘇連云港222000）

蘋果輪紋病是由葡萄座腔菌屬引起的，該病菌不僅會危害生長期的果樹和果實，也會造成果實成熟期的爛果、落果，并且在貯藏期也會造成大量的爛果，是嚴重危害蘋果產業的病害之一。除危害蘋果外，還可侵染梨、桃、杏等多種果樹，對果樹的生長和水果產量造成了巨大的影響[1-2]。目前，我國輪紋病害的防治主要是依靠化學農藥，而化學農藥的大量使用和濫用導致了環境污染、生態多樣性破壞、農藥殘留及植物病原菌產生耐藥性等一系列難題[3]。開發利用新型生物農藥可彌補化學農藥的不足，微生物制劑用于植物病害的防治受到了廣泛的重視[4-5]。芽孢菌屬繁殖力強，其芽孢可在惡劣環境中存活，并且其產生的細菌素、抗菌蛋白、脂肽類抗生素等產物具有抑菌作用，被廣泛地應用于微生物菌劑的研制[6-8]。用于植物病害防治的微生物菌株主要來源于陸地和海洋，其中來源于陸地的生物菌株開發應用比較普遍，而來源于海洋的微生物菌株，由于海洋特殊的生態環境，如高壓、高鹽、低溫、寡營養等，造就了其產物的特異結構和活性是陸源微生物無法比擬的[9-11]。很多海源微生物的次生代謝產物對植物病害的防效更好，成為近年來的研究熱點。

本課題組從連云港海域分離獲得1株對輪紋病等多種植物病原真菌具有較強抑制作用的甲基營養型芽孢桿菌BMF 04菌株。為了進一步了解該菌株特性，筆者系統研究了該菌株及其發酵液的抑菌譜以及對仁果類輪紋病病害的防效，旨在為該菌株后續開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株、培養基及果實來源

甲基營養型芽孢桿菌BMF 04由江蘇海洋大學海洋微生物實驗室分離、鑒定、保存。供試植物病原真菌（表1）和細菌保存在該實驗室。

PDA馬鈴薯培養基；PD液體培養基；NA液體培養基；發酵培養基：麩皮1.0%，花生餅粉1.0%，CaCl21.0%，pH 7.5。

梨：市售雪梨；蘋果：市售紅富士。

1.2 BMF 04菌株及其無菌發酵液對植物病原真菌抑菌作用的測定

將4℃下保存的BMF 04菌株在無菌條件下轉接于PDA斜面上，在28℃的條件下培養1 d進行活化；將4℃下保存的植物病原真菌在無菌條件下轉接于PDA平板上，在28℃培養3 d進行活化，備用。

采用平板對峙培養法，在PDA平板中央接種直徑為7 mm的病原真菌菌苔，在真菌三邊距培養皿邊緣25 mm處劃線接種活化1 d的BMF 04菌株，以不接BMF 04菌株作為對照，3次重復。28℃培養3～5 d，觀測并測量抑菌帶寬度。

表1 BMF 04 菌株及其無菌發酵液對不同植物病原真菌的抑制作用測定結果

將甲基營養型芽孢桿菌BMF 04接種于PDA斜面，在溫度為28℃條件下，培養16 h，用PD培養基洗下，制成菌懸液，接入裝有60 mL種子液培養基的250 mL三角瓶中。在溫度為28℃條件下，180 r/min搖床培養16 h，得到種子液，調整種子液濃度為108CFU/mL。按照10%的接種量，將種子液接種裝入盛有60 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中；在溫度為28℃條件下，180 r/min搖床培養48 h，發酵液冷卻至4℃，以10 000 r/min轉速離心20 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾去除菌體，即為無菌發酵液。

采用牛津杯法，將植物病原真菌接在直徑90 mm的平板中央，在距邊緣25 mm處對稱放置4個牛津杯，3個牛津杯中各加入無菌發酵液200 μL，以發酵培養基為對照，重復3次。28℃下恒溫培養4 d后，觀察植物病原真菌的生長情況，并測量其抑菌帶寬度。

1.3 BMF 04菌株發酵液對不同細菌抑制作用的測定

采用牛津杯法，將斜面培養24 h的5種供試細菌接種至盛有60 mL NA液體培養基的250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min振蕩培養24 h，制成濃度為106CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌懸液均勻涂布在NA平板上，每個涂菌平板上等距離擺放4個牛津杯。牛津杯中加入200 μL BMF 04菌株的無菌發酵液，以等量的發酵培養基為對照，28℃下培養36 h，測定抑菌帶寬度，重復3次。

1.4 BMF 04菌株發酵液及其無菌發酵液對梨、蘋果果實輪紋病防治作用的測定

蘋果、梨果實表面的處理:選擇健康果形大小一致的蘋果和梨的果實，對其表面消毒后，在果實的赤道處打直徑為7 mm、深度為3 mm的傷口，每個果實3個傷口。用2種不同處理方法分別測定BMF 04菌株發酵液和無菌發酵液的保護作用和治療作用。

保護作用：在傷口處分別用濃度為108CFU/mL BMF 04發酵液和無菌發酵液100 μL處理，以等量的發酵培養基為對照，16 h接種蘋果輪紋病菌菌苔。

治療作用：在果實傷口處接種輪紋病菌菌苔，16 h后分別接種濃度為108CFU/mL BMF 04發酵液、無菌發酵液100 μL。

將不同處理的果實放入相對濕度為95%左右、28℃的恒溫培養箱中，觀察5～7 d，采用十字交叉法測量病斑直徑。每個處理設3重復，每個重復10個果實。

2 結果與分析

2.1 BMF 04菌株及其無菌發酵液對不同植物病原真菌的抑制作用

從表1和圖1可見，BMF 04菌株對供試的26種植物病原真菌絲生長均具有明顯的抑制作用，對23種真菌的抑菌帶寬度達18 mm以上，其中對芒果炭疽病菌抑制作用最強，抑菌帶寬度為28.67 mm，其次是小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、番茄早疫病菌，抑菌帶寬度均超過27 mm。

圖1 BMF 04 菌株對不同植物病原真菌的抑制作用

從表1和圖2可見，BMF 04菌株無菌發酵液對供試的植物病原真菌均有抑制作用，對24種真菌的抑菌帶寬度在10 mm以上，其中對蘋果輪紋病菌和芒果炭疽病菌的抑制作用最強，抑菌帶寬度分別為23.50 mm和23.00 mm，對水稻胡麻斑病菌和馬鈴薯晚疫病菌抑菌作用最弱，抑菌帶寬度分別為6.67 mm和4.67 mm。

圖2 BMF 04 無菌發酵液對不同病原真菌的抑制作用

2.2 BMF 04菌株發酵液對不同細菌的抑制作用

從表2和圖3可知，BMF 04菌株對供試的金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，抑菌帶寬度為20.55 mm，其次是青枯病菌，抑菌帶寬度為11.83 mm，對大腸桿菌、角斑病菌和枯草芽孢桿菌沒有抑制作用。

表2 BMF 04 菌株無菌發酵液對不同細菌的抑制作用

圖3 BMF 04 菌株對不同細菌的抑制作用

2.3 BMF 04菌株發酵液及其無菌發酵液對梨、蘋果果實輪紋病防治作用

從表3可見，經BMF 04菌株發酵液處理過的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為21.03、18.03 mm，經無菌發酵液處理過的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為24.60、22.60 mm，無菌發酵培養基為對照組的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為43.10、53.87 mm；BMF 04菌株發酵液對梨、蘋果的保護作用分別為61.15%、76.47%，無菌發酵液對梨、蘋果的保護作用分別為51.24%、66.72%。以上結果表明，BMF 04菌株發酵液的抑菌作用明顯優于無菌發酵液；BMF 04菌株對蘋果和梨具有很強的保護作用，且對蘋果果實輪紋病的保護效果優于梨果實上輪紋病的保護效果。

從表4可知，先接種輪紋病菌，后接種BMF 04菌株發酵液的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為29.03、32.13mm，接種無菌發酵液的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為34.17、36.77 mm，無菌發酵培養基為對照組的梨、蘋果輪紋病病斑直徑分別為44.53、59.10 mm；BMF 04菌株發酵液對梨、蘋果的治療作用分別為41.30%、51.77%，無菌發酵液對梨、蘋果的治療作用分別為27.67%、42.88%。以上結果表明，BMF 04菌株發酵液對蘋果、梨輪紋病具有較好的治療作用，且對蘋果果實輪紋病的治療效果優于梨果實上輪紋病的治療效果。

對比表3和表4可以看出，海洋細菌BMF 04菌株發酵液及其無菌發酵液對蘋果、梨果實的輪紋病都具有良好的防效，且該菌株對果實的保護效果優于治療效果。

表3 BMF 04 菌株發酵液和無菌發酵液對梨、蘋果果實輪紋病的保護作用

表4 BMF 04 菌株發酵液和無菌發酵液對梨、蘋果果實輪紋病的治療作用

3 結論與討論

甲基營養型芽孢桿菌BMF 04菌株及其發酵液對供試的26種植物病原真菌和2種細菌均具有抑制作用，該菌株對23種真菌的抑菌帶寬度達到了18 mm以上，無菌發酵液對24種真菌的抑菌帶寬度達到了10 mm以上，其中對蘋果輪紋病菌和芒果炭疽病菌的抑制作用最強，抑菌帶寬度分別為23.50 mm和23.00 mm，說明其抗菌譜較廣。目前，應用于植物防病促生的芽孢菌屬主要為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[12]，關于甲基營養型芽孢桿菌在植物病害的防治應用近年來也有所報道。甲基營養型芽孢桿菌BAC-9912、WF-3對黃瓜灰霉病和炭疽病的防效分別達78.8%、77.38%[13-14]。從海洋中分離篩選的甲基營養型芽孢桿菌SHB114和BH21，能有效抑制黃瓜枯萎病、炭疽病、立枯絲核菌和葡萄灰霉病[15-16]。分離自天然餅肥發酵液的甲基營養型芽孢桿菌4-L-16菌株在香蕉根際土壤和植物體內具有良好的定殖能力，是防治香蕉枯萎病的新菌種資源[17]。趙文珺等[18]室內盆栽實驗表明，甲基營養型芽孢桿菌NK、G-1對番茄白粉病防效分別達87.55%、47.74%，且能不同程度促進番茄的生長。本研究中的BMF 04菌株與上述報道的菌株相比抗菌譜較廣，抗菌種類也有明顯不同。該菌株的發酵液和無菌發酵液對蘋果和梨的輪紋病均具有防治作用，且保護效果優于治療效果，發酵液的防效優于無菌發酵液的防效，對蘋果的保護效果及治療效果分別為76.47%、51.77%。

本研究說明甲基營養型芽孢桿菌BMF 04是一株具有廣譜抗菌性的海洋細菌，對果實輪紋病具有良好的防效，在植物病害的微生物防治方面具有廣泛的應用前景。