丙硫菌唑在不同類型土壤中的降解特性

2020-12-26 04:44:18孫明娜段勁生高同春

現代農藥 2020年6期

董旭，孫明娜，褚玥，童舟，王梅，段勁生，高同春

（安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所/農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（合肥），合肥 230031）

丙硫菌唑（prothioconazole），其分子式為C14H15Cl2N3OS（圖1（a）），化學名稱為(RS)-2-[2-(1-氯環丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羥基丙基]-2，4-二氫-1,2,4-三唑-3-硫酮，是一種新型三唑類廣譜殺菌劑，由拜耳作物科學公司（德國）研發生產。自2004年始，先后在德國、英國、澳大利亞、法國、美國、加拿大等國取得登記，于2018年12月在我國獲準登記。丙硫菌唑作為一種高效廣譜殺菌劑，主要用于防治谷類、麥類、豆類等由擔子真菌、子囊菌、半知菌等真菌引起病害的作物，其作用機理是通過抑制真菌甾醇前體，導致真菌細胞膜功能、形態等發生變化[1-4]。相對于傳統殺菌劑，丙硫菌唑不僅有良好的內吸活性，而且持效期長，另外具有較高的防病效果。通過對丙硫菌唑的苯環和三唑環C14標記研究發現，在室外環境中施藥后丙硫菌唑在作物和土壤中受光照、溫度、濕度、pH、微生物等因子影響，快速脫硫代謝為脫硫丙硫菌唑[5]（圖1（b））。目前，與丙硫菌唑相關研究報道多為其在土壤、水果、蔬菜、小麥、動物源產品等中的殘留情況，其相關的室內土壤降解研究未見報道[6-8]。

圖1 丙硫菌唑和脫硫丙硫菌唑結構式

目前我國農藥有效利用率約為30%，大部分農藥通過各種形式最終進入土壤、地下水等環境介質。農藥進入環境介質后在微生物、光照、溫度等條件影響下發生降解、移動等行為，因此，判斷某種農藥對生態環境是否安全，可以通過其在土壤中的降解特性進行評價[9]。農藥在土壤中的降解特性除了與化合物本身的理化性質有關外，還與土壤的pH值、土壤類型、土壤有機質含量、土壤微生物量等環境因子密切相關。筆者在實驗室條件下研究了不同類型土壤中丙硫菌唑的降解特征，并研究了好氧、厭氧、模擬水稻田條件對其降解速率的影響，旨在為其環境安全性評價提供參考[10-12]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

97.0%丙硫菌唑標準品和99.5%脫硫丙硫菌唑標準品，德國Dr.EhrenstorferGmbh公司；無水硫酸鈉（分析純）、氯化鈉（分析純），甲醇、乙腈（色譜級）、Carb/NH2固相萃取小柱（Carb 300 mg/NH2，500 mg/6 mL），美國安捷倫科技有限公司。

LC-MS-8030超高效液相色譜串聯質譜儀，日本島津公司；Milli-Q Direct 8超純水機，德國默克密理博公司；Y-4恒溫振蕩器，江蘇金壇金城國勝試驗儀器廠；R-100旋轉濃縮蒸發器，瑞士步琦儀器設備有限公司；390HE電子天平，瑞士普利賽斯公司。

1.2 供試土壤

分別從安徽、江西和吉林采集有代表性的耕作層土壤（安徽選擇水稻土、江西選擇紅土、吉林選擇黑土），采集后陰干除去土壤中殘留的根系、石塊等雜質，再粉碎、陰干、過篩（2 mm），保存于2～4℃避光環境中備用，保存期為6個月。土壤理化性質見表1。

表1 土壤理化性質

1.3 檢測方法

色譜柱：Shim-pack XR-ODS-Ⅲ，2.0 mm×50 mm，1.6 μm；流動相A：5 mmol/L乙酸銨＋0.02%甲酸（體積比）的水溶液，流動相B：乙腈；柱溫40℃；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。梯度洗脫：初始B相15%；0～1.5 min，B相15%～95%；1.5～3.0 min，B相保持95%；3.1 min，B相降為15%；3.1～5.0 min，B相保持15%。

離子源：ESI（±）；接口電壓：＋4.5 kV；霧化氣：氮氣3.0 L/min；干燥氣：15 L/min；碰撞氣：氬氣，230 Ka；脫溶劑管溫度：250℃；加熱模塊溫度：450℃；丙硫菌唑及其脫硫丙硫菌唑質譜優化參數見表2。

1.4 土壤前處理方法

取樣凍干，稱取凍干土壤樣品20 g于錐形瓶中，加入乙腈和水（V∶V=40∶10）混合溶液50 mL，放入恒溫振蕩器中，室溫下（25℃）振蕩提取40 min；取出加入4～5 g氯化鈉后繼續在室溫下振搖5 min，將提取液全部過濾轉移至50 mL離心管中，4 500 r/min下離心3 min，室溫靜置20 min；取上清液2 mL至裝有100 mg無水MgSO4及100 mg PSA吸附劑的10 mL離心管中，3 000 r/min渦旋1～2 min，取出放入離心機中，于5 500 r/min下離心5 min；過0.22 m濾膜，待測。

表2 丙硫菌唑及其脫硫丙硫菌唑質譜優化參數

1.5 丙硫菌唑及脫硫丙硫菌唑標準溶液配制及標準曲線繪制

準確稱取97%丙硫菌唑標準品、99.5%脫硫丙硫菌唑標準品，用色譜乙腈做溶劑，配制供試物標準品儲備液，保存于-20℃避光環境。試驗前用色譜乙腈稀釋1組5.0～0.005 μg/mL的系列混合標準品溶液，按照1.3檢測方法進行測定，繪制標準曲線。

1.6 丙硫菌唑及脫硫丙硫菌唑添加回收試驗

選擇空白安徽水稻土、江西紅土和吉林黑土，分別添加丙硫菌唑和脫硫丙硫菌唑標液，試驗設3個添加5次重復，按1.4的處理方法和1.3的檢測方法分析，分別計算丙硫菌唑、脫硫丙硫菌唑回收率和相對標準偏差（RSD）。

1.7 試驗方法

1.7.1 土壤預培養（好氧及厭氧實驗）

室溫下（25±2℃）稱取適量3種試驗用土壤樣品，在好氧及厭氧條件試驗中均不少于2 kg，均勻噴入超純水，潤濕后混勻，加水至土壤飽和持水量的40%，置恒溫培養箱中鼓風，避光培養14 d（記錄溫度范圍24.7～25.2℃）。為保持初始持水狀態，預培養過程中需及時補水。

1.7.2 供試物水溶液配制

取10 000 μg/mL的丙硫菌唑標準儲備液，用超純水稀釋成1 000 μg/mL水溶液，于2～4℃避光環境中保存。

1.7.3 好氧降解試驗

分別稱取安徽水稻土、江西紅土和吉林黑土各20 g（精確到0.01 g）于250 mL棕色瓶中，取配置好的丙硫菌唑水溶液，均勻滴加200 μg至土壤表面，待水分揮發后，渦旋混勻，使丙硫菌唑均勻分布土壤中，此時其初始質量比為10 μg/g。調節土壤飽和持水量至60%，硅膠塞（帶砂芯）蓋上瓶口，置于恒溫培養箱（25℃）中鼓風避光培養1個丙硫菌好氧半衰期（記錄溫度范圍24.1～25.3℃）。實驗設置2個重復，上述條件下分別培養0、2、4、6、8、16 h，1、2、3、4、5、7、10、14、21、30、45、60、90 d。選擇另一恒溫培養箱，設置空白對照樣品。取樣后及時測定，或將樣品置于-20℃下避光保存。

1.7.4 厭氧降解試驗

分別稱取安徽水稻土、江西紅土和吉林黑土各20 g（精確到0.01 g）于250 mL棕色瓶中，取配置好的丙硫菌唑水溶液，均勻滴加200 μg至土壤表面，待水分揮發后，渦旋混勻，使丙硫菌唑均勻分布土壤中，此時其初始質量比為10 μg/g。調節其土壤飽和持水量至60%，硅膠塞（帶砂芯）蓋上瓶口，置于恒溫培養箱（25℃）中鼓風避光培養1個丙硫菌唑好氧半衰期（記錄溫度范圍24.7～25.6℃）；取出后加超純水至液面約1～3 cm后通入氮氣，恒溫恒濕（溫度25℃、相對濕度60%），避光培養（記錄溫度范圍24.8～25.2℃、相對濕度范圍59%～62%）。實驗設置2個重復，上述條件下分別培養0、2、4、6、8、16 h，1、2、3、4、5、7、10、14、21、30、45、60、90 d。選擇另一恒溫培養箱，設置空白對照樣品。取樣后及時測定，或將樣品置于-20℃下避光保存。

1.7.5 水稻田厭氧降解試驗

室溫下（25±2℃）分別稱取安徽水稻土、江西紅土和吉林黑土各50 g（精確到0.01 g）于250 mL棕色瓶中，加超純水至土壤表面積存0.5～1.0 cm，放入通氮系統，設置恒溫恒濕培養箱溫度25℃，相對濕度60%，避光培養14 d（記錄溫度范圍24.2～25.7℃、相對濕度范圍58%～61%）。用移液器向土層中均勻加入500 μg丙硫菌唑，于恒溫恒濕培養箱中繼續培養（記錄溫度范圍24.9～25.6℃、相對濕度范圍59%～61%）。實驗設置2個重復，上述條件下分別培養0、2、6 h，1、3、5、7、14、21、30、45、60、90、120 d。選擇另一恒溫培養箱，設置空白對照樣品。取樣后及時測定，或將樣品置于-20℃下避光保存。

1.8 數據處理

1.8.1 丙硫菌唑殘留

丙硫菌唑室內土壤降解實驗在恒溫避光條件下進行，為保證實驗的準確性，其殘留量總量按式（1）計算：

式中：C為丙硫菌唑殘留總量；Ca、Cb分別為丙硫菌唑、脫硫丙硫菌唑的殘留量；R為母體分子量與代謝物分子量比值，取R=1.102 7。

設丙硫菌唑和代謝產物脫硫丙硫菌唑的檢測限分別為La、Lb，丙硫菌唑殘留總量計算分以下4種情況：

（1）若Ca≥La，Cb≥Lb，則C=Ca＋1.102 7 Cb；

（2）若Ca＜La，Cb≥Lb，則C=La＋1.102 7 Cb；

（3）若Ca≥La，Cb＜Lb，則C=Ca＋1.102 7 Cb·Lb；

（4）若Ca＜La，Cb＜Lb，則C=0。

1.8.2 半衰期計算土壤中丙硫菌唑的降解按一級動力學方程ct=c0e-kt進行擬合，降解半衰期按t1/2=ln2/k計算。

1.9 土壤降解等級劃分

丙硫菌唑在土壤中的降解特性等級參照GB T 31270.1—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》[13]進行劃分。

2 結果與分析

2.1 方法的線性范圍、準確度及精密度

丙硫菌唑及脫硫丙硫菌唑在0.005～5 μg/mL范圍內，峰面積與質量濃度間線性關系均良好。線性方程：①丙硫菌唑，y=330 826.249 3 x＋42 861.959 3，r=0.997；②脫硫丙硫菌唑，y=1 181 676.611 3 x＋192 452.531 3，r=0.996，添加水平在0.08～10 μg/g范圍內。丙硫菌唑在3種土壤中的平均回收率為83.6%～104%，相對標準偏差為0.40%～5.86%；脫硫丙硫菌唑在3種土壤中的平均回收率為80.1%～98.4%，相對標準偏差為0.21%～9.56%。丙硫菌唑及脫硫丙硫菌唑在3種土壤中的最低檢出量均為0.08 μg/g，丙硫菌唑、脫硫丙硫菌唑的最低檢出限均為2.5×10-11g。儀器對丙硫菌唑的最低檢出限為1×10-11g，脫硫丙硫菌唑為5×10-12g（以3倍信噪比計算），滿足殘留試驗準則要求[14]。結果見表3、表4。

表3 丙硫菌唑的添加回收率及相對標準偏差(n=5)

表4 脫硫丙硫菌唑的添加回收率及相對標準偏差(n=5)

表5 丙硫菌唑好氧降解參數

2.2 好氧條件降解特性

丙硫菌唑在土壤中降解半衰期由小到大依次為黑土（13.3 d）、水稻土（17.6 d）、紅土（18.9 d）（表5）。試驗中3種供試土壤的pH值、有機質及黏粒含量均不相同。在本實驗條件下，降解半衰期隨土壤有機質及黏粒含量增加而縮短（圖3），降解動態曲線符合一級動力學方程。

施用丙硫菌唑后很快形成脫硫代謝產物脫硫丙硫菌唑，通過母體苯環C14標記發現，其經化學或生物作用逐步分解，最后在土壤中礦化生成二氧化碳，并被植物吸收后進入自然循環狀態[15]。與自然環境相比，室內土壤降解試驗主要與土壤本身的有機質含量、pH值及粒徑分布等因子有關[16]。高有機質含量的土壤利于微生物生長繁殖，豐富的微生物數量和種群加速農藥在土壤中的降解（圖2、圖3）[17]。

圖2 丙硫菌唑好氧降解曲線

圖3 好氧條件下丙硫菌唑降解速率隨有機質含量和黏粒含量的變化趨勢

2.3 厭氧條件降解特性

厭氧條件下丙硫菌唑降解速率低于好氧條件，降解半衰期由小到大依次為黑土（30.3 d）、水稻土（41.5 d）、紅土（53.1 d）（表6）。

表6 丙硫菌唑厭氧降解參數

厭氧實驗先經過氧培，這一階段土壤中好氧微生物的生物活性沒有改變，而后加水至1～3 cm高，并通入氮氣使實驗系統處于厭氧環境，此時土壤表面積水、氧氣交換能力減弱，持續通入的氮氣使得土層和水層含氧量逐漸降低，抑制了好氧微生物的活性，因此與好氧條件相比，丙硫菌唑在3種土壤中的半衰期均有不同程度的延長，但降解半衰期也是隨土壤有機質及黏粒含量增加呈縮短趨勢（圖4、圖5）[18-19]。

圖4 丙硫菌唑厭氧降解曲線

圖5 厭氧條件下丙硫菌唑降解速率隨有機質含量和黏粒含量的變化趨勢

2.4 水稻田厭氧降解特性

與好氧及厭氧條件相比，丙硫菌唑降解半衰期均有所延長，降解半衰期從小到大依次為黑土（32.2 d）、水稻土（45.3 d）、紅土（54.7 d）（表7）。

表7 丙硫菌唑水稻田厭氧降解參數

土壤降解主要以微生物降解和水解為主，積水厭氧條件下，不斷通入的氮氣逐漸降低系統中氧氣的含量，抑制了土壤中好氧微生物的活性，降低了微生物對農藥的降解能力，丙硫菌唑的降解半衰期得到不同程度的延長[17-19]。積水厭氧條件下，3種供試土壤的有機質含量、pH值及粒徑等存在差異，使得丙硫菌唑降解速率有所不同。此時，土壤pH值對農藥的水解作用也有一定的影響，但降解半衰期亦隨土壤有機質及黏粒含量增加呈縮短趨勢（圖6、圖7）。