SAA水平及其基因多態(tài)性分析在川崎病中的臨床研究價值*

張 娟，陳 穎，易秀英，劉 飛，李 紅，姚永明，紀(jì) 青

(株洲市中心醫(yī)院兒科，湖南株洲 412000)

川崎病(KD)也稱黏膜皮膚淋巴結(jié)綜合征，其主要臨床癥狀為持續(xù)性高熱、口腔黏膜炎、結(jié)膜充血、手足硬性腫脹、多形性皮疹和非化膿性淋巴結(jié)腫大、手足蛻皮等[1]。KD是一種多系統(tǒng)血管炎，可以導(dǎo)致冠狀動脈病變[2]，KD在低齡兒童中更為常見，大多數(shù)的KD發(fā)生在5歲以下，男性與女性的比例約為1.5∶1.0[3]。KD的病因尚不明確，隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，許多研究集中于基因多態(tài)性與KD之間的關(guān)系。血清淀粉樣蛋白A(SAA)是一種急性期蛋白和炎癥標(biāo)志物，在急性期早期，免疫系統(tǒng)被激活，由此異常活化的T淋巴細(xì)胞釋放大量的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子刺激肝臟合成SAA。SAA長期以來被認(rèn)為是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床進展和預(yù)后的預(yù)測因子，也是冠狀動脈疾病、心血管疾病預(yù)后和急性冠脈綜合征早期死亡的預(yù)測因子[4]。在缺血性心肌病患者中，SAA水平明顯升高，而擴張型心肌病患者中SAA水平升高程度不及缺血性心肌病患者[5]。近年來關(guān)于SAA在心血管疾病中的研究發(fā)現(xiàn)，SAA也可能作為大動脈炎的生物標(biāo)志物[6-7]。本次研究旨在闡述KD中SAA水平變化，以及對SAA基因多態(tài)性與KD易感性及KD冠狀動脈損傷之間的關(guān)聯(lián)進行研究，了解SAA在KD發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016-2019年在株洲市中心醫(yī)院住院的90例漢族KD患兒作為KD組，其中男58例，女32例，男女比例為1.8∶1.0，年齡為6月至5歲，平均年齡為2.75歲，所有患兒在采血前沒有經(jīng)過人免疫球蛋白(IVIG)及阿司匹林治療；均符合KD診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。為進一步探究SAA基因多態(tài)性與KD冠狀動脈損傷之間的關(guān)系，將KD組按照有無冠狀動脈損傷分為KD合并冠狀動脈損傷(KD-CAL組)和KD無冠狀動脈損傷(KD-NCAL組)。冠狀動脈損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)：左冠狀動脈或右冠狀動脈的內(nèi)腔直徑>3 mm(5歲以下兒童)，>4 mm(5歲及以上兒童)，或一段冠狀動脈內(nèi)徑至少是相鄰冠狀動脈的1.5倍或冠狀腔明顯不規(guī)則。選取100例健康兒童作為對照組，無心血管疾病及既往無KD病史，其中男63例，女37例，男女比例為1.7∶1.0，年齡為6月至5歲，平均年齡為3.48歲，對照組及KD組性別比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.043，P=0.836)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1SAA檢驗方法 采用深圳市國賽生物技術(shù)有限公司提供的SAA定量試劑盒(散射免疫比濁法)測定SAA水平(>10 mg/L為異常)，按試劑說明進行操作；KD患兒入院后，在使用IVIG及阿司匹林前后分別空腹采集靜脈血2 mL，對照組兒童空腹采取靜脈血2 mL，分次檢驗。

1.2.2DNA提取和基因多態(tài)性檢測 應(yīng)用Promega DNA提取試劑盒，提取血液DNA，按照說明書進行操作。檢測水平和純度后置于-20 ℃冰箱保存，選擇SAA1基因多態(tài)性位點rs12218和SAA2基因多態(tài)性位點rs2468844檢測，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增基因，使用引物的序列為rs12218上游引物：AGTGGATGGTAGGAGTGAGTGA，下游引物：TACTTTGTGGTATAGACTGCCTGT。rs2468844上游引物：ATGCCATATCTCAGCTTCTCTGGAC，下游引物：GGAGGAGTGAAAACACTGACCC(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。PCR的反應(yīng)體系為25 μL：T3 Super PCR混合液22 μL(北京擎科生物技術(shù)公司)，上游引物1 μL(北京擎科生物技術(shù)公司)，下游引物1 μL(北京擎科生物技術(shù)公司)，DNA 1 μg。PCR的反應(yīng)條件如下，rs12218：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 s，35個循環(huán)，72 ℃終末延伸2 min，4 ℃保存。rs2468844：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 s，35個循環(huán)，72 ℃終末延伸2 min，4 ℃保存。反應(yīng)在PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)上進行。擴增產(chǎn)物送到測序公司(上海鉑尚生物技術(shù)有限公司)進行基因測序。測序結(jié)果在Chromas軟件(澳大利亞Technelysium公司)中進行閱讀分析。

2 結(jié) 果

2.1KD組臨床資料 在KD組中，發(fā)熱90例(100.0%)，皮疹68例(75.6%)，球結(jié)膜充血41例(45.6%)，草莓舌69例(76.7%)，頸部非化膿性淋巴結(jié)腫大70例(77.8%)，手足硬腫50例(55.6%)，指端脫皮61例(67.8%)，肛周脫皮50例(55.6%)，冠脈損傷25例(27.8%)。

2.2KD組與對照組SAA水平比較 KD患兒SAA水平治療前為(434.72±168.50)mg/L，治療后為(20.23±7.11)mg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.548，P<0.01)，治療前KD組與對照組SAA水平[(3.83±2.60)mg/L]比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.619，P<0.01)。

2.3SAA基因PCR產(chǎn)物圖 SAA1基因rs12218位點的擴增產(chǎn)物片段為525 bp，SAA2基因rs2468844位點的擴增產(chǎn)物片段為380 bp，擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳分離，見圖1、2。基因直接測序法測序結(jié)果見圖3、4。SAA1基因rs12218位點的基因型和等位基因頻率在對照組和KD組的分布經(jīng)Hardy-Weinberg吻合度檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.66、5.76，P>0.05)。SAA2基因rs2468844位點的基因型和等位基因頻率在對照組和KD組的分布經(jīng)Hardy-Weinberg吻合度檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.15、0.66，P>0.05)。結(jié)果與預(yù)期一致。

注：M為DNA Marker；1、2、3為SAA1基因位點rs12218PCR產(chǎn)物。圖1 SAA1基因位點rs12218 PCR產(chǎn)物凝膠電泳

注：M為DNA Marker；1、2、3為SAA2基因位rs2468844 PCR產(chǎn)物。圖2 SAA2基因位點rs2468844 PCR產(chǎn)物凝膠電泳

注：A為TC基因型；B為TT基因型；C為CC基因型。圖3 SAA1rs12218位點基因測序圖

注：A為TC基因型；B為TT基因型。圖4 SAA2 rs2468844位點基因測序圖

2.4SAA1rs12218位點基因型及等位基因分布 SAA1rs12218位點的TT、TC、CC基因型分布與T、C等位基因在KD組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TT、TC、CC基因型分布與T、C等位基因在KD-CAL組與KD-NCAL組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 SAA1rs12218基因型及等位基因分布與KD易感性的關(guān)系(n)

2.5SAA2rs2468844位點基因型及等位基因分布 SAA2rs2468844位點的TT、TC、CC基因型分布與T、C等位基因在KD組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TT、TC、CC基因型分布與T、C等位基因在KD-CAL組與KD-NCAL組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 SAA2rs2468844基因型及等位基因分布與KD易感性的關(guān)系(n)

3 討 論

KD好發(fā)于5歲以內(nèi)的幼兒，是一種以全身性中、小血管炎為主要病變的急性發(fā)熱出疹性疾病，是兒童后天性心臟病最常見的病因之一[9]，其發(fā)病機制及病因不明。

SAA是一種急性時期蛋白，在機體發(fā)生炎癥時其水平快速上升，是目前最敏感的炎癥標(biāo)志物之一，近期研究發(fā)現(xiàn)SAA水平與冠心病、腦出血等心血管疾病的嚴(yán)重程度及其炎性反應(yīng)呈正相關(guān)[10-11]。高水平的SAA可能通過升高C反應(yīng)蛋白(CRP)、纖維蛋白原、白細(xì)胞介素(IL)-6水平或降低高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平在冠心病中發(fā)揮作用[10]。許多炎性因子，包括細(xì)胞因子、趨化因子、急性期反應(yīng)物(如CRP、SAA)在KD中明顯升高，提示SAA有可能參與了KD的發(fā)生機制[12]。KD患兒SAA、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的改變與其出現(xiàn)血管炎性反應(yīng)、冠狀動脈損傷有關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，SAA水平在KD患兒急性期明顯升高，使用IVIG后水平迅速下降，KD患兒SAA水平在使用IVIG前后均較對照組更高。由此可說明，SAA可能參與了KD的發(fā)生過程，SAA作為新的炎癥因子，SAA水平在KD治療前后的變化，提示炎癥參與了KD病程，與既往研究中SAA水平的監(jiān)測有助于監(jiān)測KD疾病評估療效這一結(jié)論一致[13-14]，SAA可能作為診斷KD的早期診斷指標(biāo)。

KD是一種可能與遺傳易感有關(guān)的全身性血管炎綜合征，目前已有研究發(fā)現(xiàn)，家族中既往親屬有KD病史的兒童KD患病率相應(yīng)增加[15]。 SAA可在單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)促炎和促血栓形成介質(zhì)的表達(dá)，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，在動脈粥樣硬化中SAA有促進炎癥的作用[16-17]，炎癥早期SAA通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)致斑塊失穩(wěn)，促使血栓事件的發(fā)生；SAA遺傳基因多態(tài)性與心血管疾病相關(guān)，SAA基因位點(SAA1rs12218)突變與冠心病及其預(yù)后結(jié)局相關(guān)[18-19]，SAA1rs12218 CC基因型是腦梗死的獨立危險因素[20]；SAA基因多態(tài)性(SAA1rs12218及SAA2rs2468844)基因突變在心肌梗死、頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)增厚等疾病中可能起到遺傳學(xué)標(biāo)志物的作用[21]，而SAA1rs12218 CC基因使?jié)h族冠心病的風(fēng)險增加[22]。本研究選擇SAA1rs12218位點、SAA2rs2468844位點，探討其多態(tài)性與KD及KD冠狀動脈損傷的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，KD患兒SAA1rs12218位點基因型分布與等位基因分布與健康兒童比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，SAA2rs2468844位點基因型分布及等位基因分布與健康兒童相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，KD無冠狀動脈損傷患兒SAA1rs12218、SAA2rs2468844位點基因型分布及等位基因頻率與KD合并冠狀動脈損傷患兒比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，本研究尚未發(fā)現(xiàn) SAA1rs12218、SAA2rs2468844位點與KD及其冠狀動脈損傷的發(fā)生存在相關(guān)性。

4 結(jié) 論

本研究通過監(jiān)測SAA水平在KD病程的變化，初步發(fā)現(xiàn)SAA水平可能有助于監(jiān)測KD病程，可能有助于KD的早期診斷。此外，筆者發(fā)現(xiàn)SAA基因多態(tài)性(SAA1rs12218位點和SAA2rs2468844位點)與KD遺傳易感關(guān)聯(lián)性不強，也可能與本研究樣本量不夠大有關(guān)。因此，仍然需要多個中心和大量樣本研究，以進一步揭示SAA基因多態(tài)性和KD之間的關(guān)系。