HP-OMVs對2型糖尿病患者大動脈內皮細胞LR11及動脈硬化危險因子表達水平的影響

張艷彥，晁 珂，金文龍

(延邊大學附屬醫院 內分泌科,吉林 延吉133000)

有研究表明，高膽固醇血癥、冠心病、2型糖尿病患者血清LR11水平增加，與糖代謝紊亂的生化指標(空腹血糖、HbA1c)及動脈粥樣硬化危險因素(年齡、LDL-C、頸動脈IMT)相關[1-5]，在動脈粥樣硬化動物模型的動脈斑塊內膜平滑肌細胞中的表達增高[6]。一些流行病學、血清學、組織病理學及臨床研究等提示幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori,HP)感染與動脈硬化相關[7]，亦有研究認為兩者不相關[8]。本實驗探討幽門螺桿菌外膜泡對2型糖尿病患者大動脈內皮細胞的LR11及動脈硬化危險因子表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 HP培養和HP-OMVs的提取

從哥倫比亞-腦心浸液固體培養基挑取單克隆幽門螺桿菌菌株(美國ATCC43504)活化制備種子液，并擴大培養(5% O2、10% CO2和85% N2；37℃、120 rpm)，培養4天待菌液OD600≈1時，收集菌液，10 000 rpm離心收集上清，用0.45 μm濾頭過濾去除雜質，用胞外囊泡分離試劑盒(exoEasy Maxi Kit，Qiagen，76064)收集胞外囊泡，-20℃保存備用。20 μl胞外囊泡液滴加到200目銅網表面，3-5 min后吸干殘余液體，再滴加20 μl 4%戊二醛溶液在室溫固定3-5 min，再用濾紙吸干殘余液體，用生理鹽水洗滌1次，室溫晾干，再滴加20 μl 2%磷鎢酸鈉，室溫染色3-5 min，吸干殘余液體，用生理鹽水洗滌1次，最后在電鏡下觀察HP-OMVs呈圓泡形，大小各異，直徑在50-200 nm之間(圖1)。囊泡濃度：采用BCA法(碧云天，試劑盒由中國上海Beyotime Biotechnology提供)檢測囊泡蛋白濃度。

圖1 HP-OMVs電鏡觀察

1.2 細胞培養

D-HAEC原代細胞株購自美國Lonza公司，進行復蘇、培養、傳代。實驗中使用第4代細胞、美國Thermo Fisher Scientific細胞培養箱(5%CO2、37℃)及Lonza EGM-2血管內皮細胞培養基(CC-3162)。

1.3 細胞增殖檢測

培養D-HAEC 24 h，更換90 μl EGM-2培養基，加入10 μl不同濃度(2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml、10 μg/ml)HP-OMVs，對照組加入等體積PBS。取出96孔板，每孔加入CCK-8試劑10 μl，37℃孵育2 h，使用CCK-8試劑盒(日本株式會社同仁化學研究所，Dojindo)，在450 nm處檢測吸光度(美國BioTek儀器有限公司Gen5酶標儀)并計算細胞活力，實驗重復5次。

1.4 分組

實驗分為4組，C組(對照組，即Control組，無HP-OMVs和SQ22536)，HP組(有HP-OMVs，無SQ22536)，CS組(無HP-OMVs，有SQ22536)，HPS組(有HP-OMVs和SQ22536)。6孔板鋪設D-HAEC(Passage 4)，HP組和HPS組加入HP-OMVs共同培養24 h后，CS組和HPS組加入腺苷酸環化酶抑制劑(SQ22536)作用30 min，之后提取細胞總RNA。每組n=6。

1.5 Real-time PCR

從QIAGEN公司購買Rneasy Plus Mini Kit、QuantiNova Rev Transcription Kit、QuantiNova SYBR Green PCR Kit，培養D-HAEC，提取細胞總RNA，合成cDNA，實時熒光定量PCR測定LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達水平。引物產品號:LR11(PPH06225A)，IL-1β(PPH00171C)，IL-6(PPH00560C)，MCP-1(PPH00192F)，TNF-α(PPH00341E)，VCAM-1(PPH00623E)。

1.6 統計分析

采用SPSS16.0統計學軟件，進行ANOVA分析、Pearson相關分析及多元逐步回歸分析，P<0.05示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HP-OMVs促進D-HAEC的增殖

HP-OMVs(濃度2.5、5.0、7.5、10 μg/ml)與D-HAEC共同培養24 h，用CCK-8檢測細胞活力，隨HP-OMVs濃度的增加而D-HAEC數逐漸增多，HP-OMVs濃度7.5 μg/ml、10 μg/ml時，增殖率達125%、128%，與對照組比較有顯著性差異(圖2)。本實驗采用7.5 μg/ml濃度進行后續實驗。

圖2 CCK-8檢測細胞活力

2.2 LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達

HP組與C組比較，HP-OMVs可顯著增高D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達水平，當加入腺苷酸環化酶阻滯劑(SQ22536)時，HPS組D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達水平被顯著抑制(表1)。Pearson相關性分析(表2)示LR11與IL-1β、IL-6、VCAM-1呈顯著正相關，與TNF-α有相關趨勢，多元逐步回歸分析示LR11與IL-1β最密切相關(表3)。

表1 各組間LR11及其他動脈硬化危險因素表達水平的比較

表2 LR11與其他動脈硬化危險因素的相關性

表3 LR11與其他動脈硬化危險因素的多元逐步回歸分析

3 討論

幽門螺桿菌外膜泡分泌的細胞毒素相關基因A(CagA)和空泡毒素A(VacA)毒力非常強，可引起強烈的炎癥反應[9]。有研究報道，HP感染與糖尿病的發生發展有關，引起胰島素抵抗[10]，增加炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表達[11]，促進大血管動脈硬化發生發展[12]。本實驗研究中，HP-OMVs刺激的D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1表達水平顯著增加，多因素分析示LR11與IL-1β、IL-6、VCAM-1呈顯著正相關(r=0.967、0.733、0.683)，多元逐步回歸分析示LR11與IL-1β關系最密切(B=0.046，t=7.064，P<0.01)。并且，腺苷酸環化酶阻滯劑(SQ22536)可顯著下調HP-OMVs刺激的D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1表達水平，以上研究結果示幽門螺桿菌感染可能通過調控cAMP信號通路增高LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達水平，促進糖尿病大血管動脈硬化的發生發展，其中，IL-1β可能是影響LR11的主要因素。另外，有研究報道LR11可調控血管平滑肌細胞的增值、遷移，在本研究中觀察到HP-OMVs與2型糖尿病患者大動脈內皮細胞共同培養時促進細胞增殖，這是否與LR11調控血管平滑肌細胞增值、遷移的作用有關尚不清楚。我們的前期臨床研究結果提示血清LR11水平與2型糖尿病及頸動脈IMT相關[13-15]。幽門螺桿菌與冠心病風險相關性薈萃分析示[16]，幽門螺桿菌可增加冠心病早期發展的風險，尤其是在普通人群中，而其后期影響可能被其他動脈硬化相關危險因素所削弱，其中最主要的影響因素是年齡。多項HP與動脈硬化相關性研究存在著爭議的原因可能為各項研究未能分層分析年齡因素。我們的研究結果顯示HP與動脈硬化相關，因此HP的防治有可能會降低2型糖尿病患者大血管動脈硬化發生發展的風險。