5hmc在非霍奇金淋巴瘤中免疫表型特征探討

王學菊,王雪梅,楊紹娟,王麗萍

(吉林大學中日聯誼醫院 病理科,吉林 長春130033)

DNA啟動子或編碼區CpG島甲基化可通過轉錄抑制途徑參與惡性腫瘤的發生和化療藥的耐藥[1]。胞嘧啶5’位點甲基化(5-methylcytosine，5mc)是惡性腫瘤中常見的DNA甲基化位點[2]。5mc的形成是一個可逆的過程，研究顯示TERT家族蛋白可將5mc進一步氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmc)，從而進入胸腺DNA合成途徑[3]。惡性腫瘤，包括淋巴瘤中5hmC表達缺失預后差[4-6]，提示監測5hmc表達水平有助于判斷預后和療效評估。非霍奇金淋巴瘤是最為常見的淋巴瘤類型，尚未有詳細研究探明其甲基化狀態[7]。本研究選取非霍奇金淋巴瘤代表性病例通過觀察5hmc表達情況探討其氧化途徑是否存在抑制現象。

1 材料與方法

1.1 研究資料

實驗中共收集了33例回顧性淋巴瘤病例，高侵襲性B細胞淋巴瘤16例，其中彌漫大B細胞淋巴瘤13例，FL III級1例，富于T和組織細胞的大B細胞淋巴瘤1例，Burkitt淋巴瘤1例，發病年齡23歲-81歲，男性7例、女性9例；T細胞淋巴瘤17例，其中非特殊型周圍T細胞淋巴瘤11例，單形性親上皮型T細胞淋巴瘤 3例，間變大細胞淋巴瘤、T細胞白血病和NK/T細胞淋巴瘤各1例,發病年齡26-71歲，男性11例、女性6例。

1.2 免疫組化及結果判讀

實驗病例石蠟包埋標本用于免疫組化的切片厚度為3 μm。5hmc抗體(兔源性多抗，購自Active motif公司) 1∶1500稀釋。免疫組化流程參照試劑盒說明書。5hmc為細胞核著色，所有染色切片經兩名病理科醫生判定,評分標準如下：陰性(無著色)，1-50%細胞陽性，>50%細胞陽性[8]。

1.3 統計分析

采用Graphpad Prism 8.3.0對B細胞淋巴瘤和T細胞淋巴瘤表達率進行卡方檢驗，P值小于0.05認為具有統計學差異。

2 結果

在所有檢測病例中殘存正常淋巴細胞5hmc在細胞核強陽性表達，為實驗提供內對照。結果如表1、圖1所示。和正常淋巴細胞相比，16例高侵襲性B細胞淋巴瘤7例無著色(7/16,43.7%)，8例腫瘤細胞陽性率低于50%(8/16,50%)，1例陽性細胞數大于50%(1/16,6.3%)。17例T細胞淋巴瘤病例中15例無著色(15/17,88.2%)，1例陽性細胞數低于50%(1/17,5.9%)，1例陽性細胞數大于50%(1/17,5.9%)。

圖1 非霍奇金淋巴瘤5hmc免疫表型特征代表性病例(×100)。A-C為高侵襲性B細胞淋巴瘤代表性病例表達情況。A為陰性表達，B為散在弱陽性表達，C為彌漫中等或強陽性表達。D-F為T細胞淋巴瘤代表性病例表達情況。D為陰性表達，E為散在弱陽性表達，F為彌漫強陽性表達

表1 5hmc在非霍奇金淋巴瘤中的表達情況

對B細胞淋巴瘤和T細胞淋巴瘤病例進行5hmc表達率的比較，結果顯示T細胞淋巴瘤中5hmc陰性率高于其在B細胞淋巴瘤中的陰性率(P<0.05),提示5hmc在T細胞淋巴瘤比在B細胞淋巴瘤中缺失更為普遍。

3 討論

本研究檢測了5hmc蛋白在常見的非霍奇金淋巴瘤(高侵襲性大B細胞淋巴瘤和T細胞淋巴瘤)的表達情況，發現和實體瘤類似，非霍奇金淋巴瘤5hmc缺失率高，淋巴瘤中CpG島甲基化現象普遍，而且T細胞淋巴瘤比B細胞淋巴瘤的5hmc缺失率更高。TERT基因家族蛋白與5hmc關系最為密切，髓系白血病和T細胞白血病出現TERT家族基因突變可導致5mc無法被氧化成為5hmc[9]，也有研究顯示T細胞淋巴瘤中5hmC缺失與上述突變基因之間并無對應關系[10]。

5hmc免疫表達情況或可成為檢測淋巴瘤DNA甲基化狀態的評估指標之一。 5mc氧化過程可分為主動氧化和被動氧化，主動氧化途徑經TET基因家族蛋白催化生成5hmc[3]，因此通過檢測5hmc可以提示DNA去甲基化的狀態。5hmc蛋白定位于細胞核，免疫組化簡便易行而且判讀方便，因此可將免疫組化方法作為5hmc相關表觀遺傳學研究的初步篩選途徑。

本研究不足之處在于所選擇淋巴瘤亞型以及病例數有限，在未來的研究中需要增加病例數量，并且觀察5hmc對預后和化療效果的影響，以提高結論的準確性。