miR-378初始體rs1076064多態性與中國漢族人群乳腺癌的關聯研究

趙敏君，錢瑞儀，黃 鑫，楊 陽，陳科潤，易 維，楊瑞卿，司馬秀田

(1.四川大學華西醫院 a.全科醫學科；b.神經外科，四川 成都610041;2.四川大學華西臨床醫學院，四川 成都610041；3.樂山市人民醫院 檢驗科，四川 樂山614000)

乳腺癌發病高居我國女性惡性腫瘤的首位，2015年新發病例約27.2萬，死亡病例約7萬[1]。隨著篩查技術的廣泛應用，乳腺癌5年生存率有所提高，但是約3-10%的乳腺癌患者在確診時即有遠處轉移[2]。乳腺癌的發病與多種因素有關，包括環境因素和遺傳因素等。研究組前期發現CD44相關位點rs13347多態性與乳腺癌的轉移有一定相關性[3]。然而，迄今為止，其準確發病原因仍未完全闡明。

MiRNA是生物體內廣泛存在的一類具有調控功能的非編碼RNA分子，由基因組轉錄，經過miRNA初始體(pri-mRNA)、前體miRNA等步驟的加工最終形成成熟體miRNA。人類基因組中存在上千種miRNA，其中，miR-378在乳腺癌中異常高表達[4-6]。單核苷酸多態性(SNP)rs1076064位于miR-378初始體區，有文獻報道該位點多態性與肝細胞癌和前列腺癌的發病密切相關[7,8]。本研究擬探討miR-378初始體rs1076064多態性與中國漢族女性乳腺癌發病的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本采集

病例組：共133例，來自2013-2015年樂山市人民醫院住院的乳腺癌患者。納入標準:①女性患者;②病理組織學確診為乳腺癌;③無合并其他部位原發性腫瘤。排除標準：①乳腺良性腫瘤；②有骨髓移植史患者。平均年齡 50.72±9.61歲。

對照組：共216例，來自同時期在樂山市人民醫院體檢的健康女性。排除具有乳腺癌家族史的個體。平均年齡41.21±10.13歲。

入選病例組和對照組樣本均為無關漢族個體。

1.2 儀器與試劑

聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀為杭州朗基科學儀器有限公司產品；Ion torrent PGM測序儀為美國Thermo Fisher Scientific公司產品；臺式離心機為德國eppendorf公司儀器；全基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；Taq I限制性內切酶購自美國NEB公司；擴增引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 運用試劑盒提取外周靜脈血中全基因組DNA，按照試劑盒操作說明進行。運用紫外分光光度計檢測提取DNA的濃度和純度。

1.3.2基因分型 rs1076064位點PCR擴增引物如下：5’-CGGCAAAGATCACCAGAAGA-3’(上游)，5’-CAGGTGTTTGCAGGAGCAGT-3’(下游)。經過3輪PCR，電泳割膠純化后，置于Ion torrent PGM測序儀上測序，操作步驟按照說明書進行。

1.4 統計學處理

直接計數法計算rs1076064不同基因型在病例組和對照組中的分布，運用χ2檢驗分析基因型分布是否符合Handy-Weinberg遺傳平衡，并比較兩組的相關性，以比值比(OR)和95%置信區間(CI)表示相對風險。所有數據均采用SPSS 25.0處理，P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

rs1076064多態性在乳腺癌和對照組中的分布頻率見表1，在共顯性、顯性、隱性和過顯性遺傳模型中，兩組差異均無統計學意義(P均>0.05)。根據腫瘤大小和有無淋巴結轉移進行分層分析，亦未發現rs1076064多態性與上述臨床特征之間的相關性(表2和表3)。

表1 乳腺癌組和對照組rs1076064多態性比較

表2 rs1076064與乳腺癌腫瘤大小的關聯

表3 rs1076064與乳腺癌淋巴結轉移的關聯

3 討論

miRNA在腫瘤演變過程中的調控作用得到了廣泛的認識。已經證實，乳腺癌中多種miRNA分子差異性表達，包括miR-378[4-6]。Yin等[4]報道乳腺癌中miR-378顯著高表達，用于乳腺癌診斷的曲線下面積為0.807。體外轉染miR-378可使腫瘤細胞獲得干性特征，包括促進細胞集落形成和自我更新等[5]。異位表達miR-378可通過結合于Runx1基因3’非翻譯區抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移[9]。長鏈非編碼RNA GAS5通過靶向miR-378a-5p/Hedgehog信號通路成員SuFu促進三陰乳腺癌細胞凋亡[10]。此外，miR-378(*)通過抑制轉錄因子PGC-1β的兩個伴侶ERRγ和GABPA的表達調節并誘導乳腺癌細胞的代謝轉移，從而導致三羧酸循環基因表達和氧氣消耗的減少，以及乳酸生成和細胞增殖的增加[11]。以上研究提示，miR-378有望成為乳腺癌治療的潛在靶點。

既往研究顯示，位于miRNA初始體的SNP可能作為乳腺癌的生物學標記物[12,13]。例如，攜帶miR-125a初始體的多態位點rs12976445CT和CC基因型患者中miR-125a表達較低，而原癌基因人類表皮生長因子受體2表達較高[12]。位于miR-182初始體的多態位點rs4541843-T等位基因增加了乳腺癌的發病風險[13]。最近，有報道位于miR-378初始體的多態位點rs1076064G等位基因具有較高的啟動子活性，預示著更好的肝癌預后[7]和前列腺癌疾病進展[8]。基于以上研究結果，推測rs1076064可能參與了乳腺癌的發生發展。本研究運用病例-對照研究分析了rs1076064與中國漢族女性乳腺癌的相關關系，并評估了該多態位點與乳腺癌臨床特征的關聯。

然而，本研究并未發現miR-378初始體rs1076064多態性與中國漢族女性乳腺癌發病、腫瘤大小和淋巴結轉移存在明確的相關關系。造成該陰性結果的可能原因如下：第一，本研究納入的樣本例數較少，僅有133例乳腺癌患者，無法排除假陰性結果；第二，研究設計為病例-對照研究，無法排除入選偏倚。第三，乳腺癌的發病是多因素交互作用的結果，由于本研究是回顧性分析，未考慮環境等因素的影響。因此，未來有必要進行大樣本前瞻性研究驗證本研究結果。有文獻顯示，雖然單一的rs4245739基因分型與雌激素受體陰性乳腺癌發病無關，但是rs4245739A等位基因聯合miR-184、miR-191、miR-193a、miR-378表達譜能夠區分乳腺癌的腫瘤大小和淋巴結轉移數目[14]，提示rs1076064多態性聯合多個miRNAs表達可能作為乳腺癌的風險標記物。

綜上所述，miR-378初始體rs1076064多態性與中國漢族女性乳腺癌發生和淋巴結轉移無關。未來有待進一步開展不同種族的大樣本驗證性研究及基因-基因、基因-環境交互作用和SNP-miRNA表達譜聯合分析，以期明確rs1076064- miRNAs的多因素綜合作用對乳腺癌發病的影響，為乳腺癌的早期診斷及個體化精準治療提供理論依據。