基于HPLC-MS測定淚液中小分子化學成分的研究進展

仲 潔，于艷梅

（1. 禹城市人民醫院眼科，山東 禹城 251200；2. 濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 250102）

淚液是一種可通過簡單非侵入性方式收集的生物液體。與汗液或唾液相比，淚液不易受到環境污染。淚液能潤滑角膜上皮細胞和組織，并反映人體生理狀態。由于淚液體積小、樣品濃度低，淚液小分子化學成分的測定研究對分析儀器檢測水平提出了較大挑戰[1-8]。高效液相色譜-質譜法聯用（HPLC-MS）有高靈敏度、高通量、高精確度和應用范圍廣等優勢，已廣泛用于動物、植物等微量樣品的分析和鑒定工作[9-14]。

與血液樣品相比，淚液采集創傷小，樣品復雜程度低。淚液作為血漿樣品的替代物可用于檢測治療藥物濃度。近年，基于HPLC-MS測定眼科局部給藥、口服給藥和胃部注射給藥后淚液中外源性藥物濃度的研究工作已有報道[15-23]。然而，相比血液樣品，研究者對淚液中外源性藥物的定量分析研究相對較少。另外，機體的生理狀態與淚液內源性小分子化學成分的組成有相關性[3]。目前，淚液中類固醇、脂質及多肽等內源性小分子化學成分的測定也僅有少量報道[24-30]。

1 外源性藥物的檢測

1.1 眼科局部給藥

眼科局部給藥是治療眼科疾病常用的給藥方式。貝西沙星（besifloxacin）是治療細菌性結膜炎的第四代廣譜氟喹諾酮類藥物。Su等[15]以Sepax GP苯基柱為分離柱，建立了基于HPLC-MS/MS快速、靈敏和高選擇性地定量測定兔血漿、淚液、房水、結膜和角膜中besifloxacin的新方法。采用電噴霧離子（ESI）源和多反應監測（MRM）的正離子模式，以那格列奈（nateglinide）為內標物，建立besifloxacin的分析方法。其中besifloxacin的監測躍遷為394.2→377.1，內標物的監測躍遷為318.3→166.1。血漿樣品中besifloxacin在0.103～206 ng/ml范圍內呈良好線性關系，淚液、房水、結膜和角膜樣品中besifloxacin在2.06～2060 ng/ml范圍內呈良好線性關系。該方法成功地應用于單次及多次局部給藥后兔血漿及眼組織中besifloxacin的藥動學研究。

由于環孢菌素A（cyclosporine A）水溶性低，其眼科給藥劑型受到較多關注。一種新型的水溶性cyclosporine A前藥用于治療干眼疾病[16]。研究表明，此前藥制劑有良好的眼耐受性，對基礎淚液產生無影響，并維持眼表特性不變。為了研究水溶性cyclosporine A 前藥和cyclosporine A水包油乳劑的藥動學差異，建立了一種基于超高壓液相色譜-串聯質譜技術（UPLC-MS/MS）測定cyclosporine A含量的方法，證明水溶性cyclosporine A 前藥和cyclosporine A水包油乳劑在15 min至48 h之間具有相似的藥動學過程。Cyclosporine A前藥能滲透到眼內其他組織，在眼前段和后段的組織中均達到治療濃度水平，且cyclosporine A前藥比乳劑具有更高的生物利用度和更低的消除率。

第二代氟喹諾酮衍生物氧氟沙星（ofloxacin）是目前治療和預防動物和人類眼表感染最常用的藥物之一。眼科藥物緩釋系統能提高眼科疾病治療療效，同時減少副作用和用藥頻率。為了比較新型眼科ofloxacin緩釋裝置與傳統ofloxacin滴眼液給藥方式的差異，首次建立了一種HPLC-ESI-MS/MS法測定兔眼淚中ofloxacin含量的方法[17]。該方法結果可靠、重現性好，已經成功應用于ofloxacin新型聚合物植入式裝置與常規眼用制劑的藥動學比較研究。與傳統ofloxacin滴眼劑相比，新型裝置可調節ofloxacin的釋放速度，提高其在眼內的生物利用度。為了增加氯替潑諾（loteprednol etabonate）在眼表的滯留量，改善眼內組織的藥物輸送，Glogowski等[18]研制了一種治療眼部炎癥的新型凝膠制劑。結果表明，這種凝膠制劑能延長兔眼表面loteprednol etabonate的滯留時間，并能將該藥物輸送至眼前段組織如兔結膜、角膜和虹膜睫狀體等。人和兔眼淚液中loteprednol etabonate在24 h內均維持在可測量水平。

Besifloxacin、cyclosporine A、ofloxacin和loteprednol etabonate 4種藥物均采用反相LC-MS/MS進行定量分析研究。對于含有極性功能基如多羥基、氨基或羧基的待檢測藥物，這些成分可能在反相色譜保留較弱，因此可選擇一些極性色譜固定相開展淚液樣品的分析研究。納他霉素（natamycin）是一種多羥基的大環內酯類化合物。Bhatta等[19]以氰基柱（100 mm×2 mm，3 μm）為色譜分離柱，首次建立了一種基于HPLC-MS/MS高選擇性和高靈敏度地測定兔眼淚液中natamycin含量的方法。采用ESI源和MRM的負離子模式，以兩性霉素B （amphotericin B）為內標物，建立natamycin的分析方法。Natamycin在25～800 ng/ml濃度范圍內呈良好線性關系，檢測限為12.5 ng/ml。本方法成功地用于natamycin滴眼液在新西蘭兔眼淚液的藥動學研究。奧洛他定（olopatadine）是一種含有羧基和叔胺片段的小分子藥物。Maksi? 等[20]以酰胺柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）為色譜固定相發展了一種親水作用液相色譜（HILIC）-MS/MS法測定人淚液中olopatadine含量的方法。該方法有靈敏度高、選擇性好、樣品制備簡單和色譜運行時間短等優點，可用于人淚液中olopatadine的藥動學評價。

1.2 口服給藥

口服給藥是疾病治療中常用的給藥方式，有給藥方式簡便、不直接損傷皮膚或黏膜的優點。部分研究發展了口服給藥后淚液中小分子藥物成分的分析方法。Hirosawa等[21]利用超高速LC-MS/MS快速、高靈敏地測定了人淚液和血漿中的非甾體抗炎藥物布洛芬（ibuprofen）和洛索洛芬（loxoprofen）的濃度。這是在淚液中檢測非甾體抗炎藥物的首次報道。兩種藥物在淚液和血漿中的回收率分別為96.0 %～117.0 %和99.0 %～105.7 %，并在0.02～1.0 μg/ml（淚液）和0.1～5.0 μg/ml（血漿）的濃度范圍內呈良好線性關系。該檢測方法僅需10 μl淚液和20 μl血漿即可完成定量分析，因此在臨床和毒理學分析中具有較好應用前景。

Sebbag等[22]采用HPLC-MS/MS法測定了淚液中強力霉素（doxycycline）的含量，并比較了口服給藥后Schirmer試紙和聚乙烯醇縮醛海綿兩種收集裝置采集的淚液中定量分析doxycycline的精密度。結果表明，doxycycline在貓淚液中濃度達45.1～900.7 ng/ml，犬淚液中濃度達45.4～632.0 ng/ml。與聚乙烯醇縮醛海綿相比，Schirmer試紙收集淚液方式有更高精密度。因此，Schirmer試紙是定量分析淚液中doxycycline的良好選擇。

1.3 注射給藥

Shiokawa等[23]首次報道了基于氨基鍵合固定相的HILIC-MS/MS高通量定量分析人眼淚和血漿中替加氟（tegafur）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）的新方法。他們采用大氣壓化學電離和MRM監測的負離子模式，以5-chlorouracil為內標物，建立tegafur和5-fluorouracil的分析方法。淚液和血漿樣品中藥物在0.04～4.0 μg/ml濃度范圍內呈良好線性關系。本方法成功地用于臨床樣品中tegafur和5-fluorouracil的高通量分析。

2 內源性小分子化學成分的檢測

2.1 類固醇類

干眼癥是一種多因素眼表疾病，有研究表明類固醇類組分對眼表有保護作用。為了探討干眼癥與淚液中類固醇水平的關系，Pieragostino等[24]建立了一種穩定、特異、選擇性地同時定量分析淚液中皮質醇（cortisol）、皮質酮（corticosterone）、11-脫氧皮質醇（11-deoxycortisol）、4-雄烯酮-3, 17-二酮（4-androstene-3, 17-dione）、睪丸激素（testosterone）、17α-羥孕酮（17α-hydroxyprogesterone）和黃體酮（progesterone）的方法。結果表明，干眼病患者中cortisol、11-deoxycortisol、4-androstene-3, 17-dione和17α-hydroxyprogesterone的含量明顯低于對照組。經統計分析，表明此法對干眼病有良好的預測能力。因此，淚液可用于研究眼部的病理生理狀態。

Gibson等[25]開發了一種UPLC-高分辨率（HR）-MS技術同時測定14種性類固醇標準品的方法。此法測定人淚液中progesterone、androsterone glucuronide（雄甾酮葡萄糖醛酸）和5α-雄甾烷-3α,17β-二醇（5α-androstane-3α,17β-diol）的含量。由于淚液體積小且性類固醇濃度低，因而需混合淚液樣品才能獲得足夠的樣品量進行分析。

2.2 脂質類

Schnur等[26]采用薄層色譜法、酶法和質譜法對淚液中脂質成分進行分析和鑒定。根據酶分析，含膽堿的脂類、甘油三酯和膽固醇酯的濃度分別為48±14，10±0和21±18 μmol/L。UPLC-飛行時間（TOF）-MS分析表明，極性脂類磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺占所有鑒定脂類的88 %±6 %。從生理學角度分析這些脂質成分，揭示了淚液中脂質的功能作用，為眼表疾病的治療提供了新途徑。Dean等[27]采用HPLC-MS鑒定了刺激性人眼淚中的磷酸膽堿脂質化合物，并證明了淚液中高質量數、完整的磷脂酰膽堿為淚液脂質蛋白的天然配體。

2.3 多肽和氨基酸類

內源性肽是生物學過程分析的重要指標。淚膜含有淚腺/黏膜細胞釋放的蛋白質和多肽，包括參與抵抗外源性病原體的抗微生物肽。但是，鑒定淚液中多肽含量的報道較少。Elortza等[28]采用不同的裂解方法碰撞誘導裂解（CID）、電子轉移離解（ETD）和高能誘導裂解（HCD）分別從淚液中鑒定了157，131和122個肽，共鑒定234個不同的肽，是迄今為止最大的淚液內源性多肽數據集。此法有望應用于不同的生物體液中，以鑒定和發現具有其他生物學功能的多肽，如細胞保護、抗炎或傷口愈合等，從而拓寬此法的應用范圍。

Nakatsukasa等[29]采用HPLC-ESI-MS/MS分析了人淚液中23種氨基酸組成。結果表明，氨基酸組成聚類分析能明確區分嚴重眼表疾病和非眼表疾病。與非眼表疾病組相比，嚴重眼表疾病組牛磺酸、L-蛋氨酸和精氨酸的相對含量較低，表明眼表疾病狀況可能與氨基酸變化有密切關系。

2.4 維生素類

Khaksari等[30]采用HPLC-MS法測定嬰兒及母親淚液及血清中水溶性和脂溶性維生素的水平。樣本來自于15個家庭，每對包括1個4個月大的嬰兒和1位哺乳期母親，比較每個受試者的眼淚和血清之間及嬰兒和母親之間的維生素濃度差異。結果表明，水溶性的維生素B1，B2，B3（nicotinamide），B5，B9和脂溶性維生素E（α-tocopherol）在淚液和血清中均能檢測到，然而脂溶性維生素A（retinol）僅在血清中檢測到。該工作首次實現了維生素 A、B和E的同時檢測，并明確了淚液和血清中維生素濃度之間的相關性。因而，淚液能充分反映血清中維生素水平，加快維生素缺乏癥的診斷速度。

3 淚液樣品制備

淚液是唯一可輕易獲得的非侵入性的樣品基質。淚液可通過Schirmer試紙[15,17,18,20,22,24-25,30]、聚乙烯醇縮醛海綿[22]和刻度毛細管[16,19,21,23,26-29]（玻璃或塑料）等方式收集。Raju等[31]概述了常見的淚液收集技術，強調標準化的取樣時間和體積對獲得重復性結果非常重要。由于操作簡單，較多研究工作采用 Schirmer試紙收集淚液，個別采用聚乙烯醇縮醛海綿收集。收集淚液后，常采用高速離心或者甲醇洗脫。Schirmer試紙和聚乙烯醇縮醛海綿收集淚液的缺點是滲透到試紙/海綿上的淚液體積很難準確測定，小分子化學成分的回收率也無法保證。采用玻璃或塑料毛細管直接取樣可提供準確的小體積樣品，采用小體積流動相稀釋并離心后，上清直接質譜進樣或經固相萃取步驟再進行HPLC-LC分析。毛細管直接取樣避免了從支撐材料中不完全萃取分析物的潛在風險。不論是采用Schirmer試紙/聚乙烯醇縮醛海綿取樣，還是采用毛細管取樣均應避免刺激眼睛，防止淚液的過多分泌而稀釋淚液中小分子化學成分的濃度。

4 展望

淚液體積小、濃度低，是測定淚液小分子化學成分過程中的難點，極大地限制著淚液在藥物濃度監測和代謝組學方面的研究工作。另外，即便采用毛細管能準確測定淚液體積，然而在質譜分析前，仍不可避免地稀釋淚液樣品，引起小分子化學成分濃度下降。發展淚液樣品在線預處理-微柱LCMS/MS新技術可能提高淚液小分子化學成分的檢測靈敏度和準確度，從而豐富淚液的研究手段，擴寬淚液的研究范圍。