PD-L1在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

杜舟，黃萍，黃國裕，韓少良，左志貴

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 疝與腹壁外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學 發展規劃處，浙江溫州 325035；3.溫州醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；4.溫州醫科大學附屬第一醫院 結直腸肛門外科，浙江 溫州 325015）

結直腸癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，每年有近102萬的新發病例以及約53萬的死亡病例，位居世界惡性腫瘤發病率和病死率第3位[1]。我國的結直腸癌多見于中年人，因其在臨床上常缺乏較為典型的癥狀和體征，發現及確診時多已進入癌癥中晚期，導致了我國結直腸癌第5位的高病死率，并呈現持續上升的趨勢[2-3]。免疫逃逸是腫瘤發生發展的重要機制之一，它是一個需要協同刺激分子參與的腫瘤抗原性特異性T細胞誘導凋亡和無反應性的過程[4]。程序性死亡配體-1（programmeddeathligand 1，PD-L1）是重要的協同刺激分子B7家族的成員之一，因此也稱B7-H1。研究發現，PDL1在肺癌、肝癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌及卵巢癌等多種癌組織內[5]以及多種腫瘤細胞內均存在高度表達[6]，升高的PD-L1與程序性死亡受體-1（programmed death I，PD-1）相結合，從而減弱組織的抗腫瘤免疫反應。然而，其在結直腸癌中的表達情況鮮有報道。本研究通過檢測PD-L1在結直腸癌組織、相應癌旁正常組織中的表達情況，觀察PD-L1的表達與結直腸癌患者臨床病理特征之間的相關性，探討其潛在的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 隨機選取2016年1月至2017年1月溫州醫科大學附屬第一醫院50 例結直腸癌手術患者，所有納入實驗的患者均經病理學確診為結直腸癌，且直至術前均未接受放/化療，各項臨床檢測指標完整無缺失。納入實驗的50例結直腸癌患者在術中獲取腫瘤組織用以后續實驗，并獲取在距離腫瘤組織5 cm以上的癌旁組織作為對照。納入實驗的患者，男33例，女17例，年齡（63±12）歲。入組的患者均在住院期間完成常規術前檢查，記錄腫瘤標志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）水平，術中對癌組織進行病理切片明確癌組織分化程度，淋巴結轉移情況，并且追蹤并記錄是否進行化療。本研究經本院倫理委員會批準，所有入組患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR:使用TRIzol試劑（美國Promega公司）從組織中提取總RNA并進行定量。將1 μg RNA進行反轉錄（反轉錄試劑盒購自美國Promega公司）以合成cDNA。隨后，在基因特異性引物的存在下，用SYBR Premix ExTq（日本Takara公司）對cDNA和ROX II的混合物進行實時定量PCR。下一步，在CFX96實時PCR檢測系統（美國Bio-RAD公司）中根據PCR標準化方案定量轉錄PD-L1。采用管家基因β-actin作為內部對照。引物序列見表1[7]。

表1 PCR引物序列

1.2.2 Western blot:將組織進行勻漿并使用裂解緩沖液[50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.5%Nonidet-40，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF（pH 8.0）]進行裂解，然后在13 000×g、4 ℃下離心30 min。通過BCA蛋白質測定試劑盒（上海碧云天公司）確定上清液中的蛋白質濃度。隨后，通過在4×nuPAGE上樣緩沖液（美國Life Technologies公司）中加入20 μg在100 ℃下加熱5 min后變性的等量蛋白質，通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（美國Life Technologies公司）電泳進行跑膠，并將蛋白轉膜至PVDF膜（美國Millipore公司）上。用含有0.05% Tween-20的Tris緩沖液（TBST）配制5%脫脂牛奶進行封閉，隨后用抗體（英國Abcam公司）PD-L1（1:10 000）、β-actin（1:5 000）在4 ℃下孵育過夜。第2天使用二抗孵育，并使用Image Lab軟件（美國Bio-Rad公司）進行掃描和半定量分析。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0統計學軟件進行數據分析。計量資料用表示，2組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗，計數資料分析采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1在結直腸癌組織、癌旁正常組織中的表達 在50例結直腸患者中，PD-L1 mRNA水平在癌組織中顯著高于癌旁正常組織（1.00±0.20 vs.1.86±0.61，P＜0.05）。與癌旁組織相比，結直腸癌組織中PD-L1 蛋白表達量也顯著升高（0.32±0.22 vs.1.21±0.68，P＜0.05）。選取5例患者的Western blot條帶圖，較為典型地展示同一患者癌組織與癌旁組織PD-L1蛋白水平的差異，見圖1。

2.2 結直腸癌組織中PD-L1的表達與臨床病理特征的關系 在結果2.1中，將Western blot條帶灰度值為0判斷為PD-L1蛋白陰性（-）表達，將其余判定為PD-L1蛋白陽性（+）表達。通過統計分析，PD-L1的表達在性別、年齡、部位以及組織學分類及術前CEA、CA199水平中差異無統計學意義（P＞0.05）；PD-L1在中低分化的癌組織中表達陽性率高于高分化癌組織（P=0.050）；PD-L1的表達與淋巴結轉移與否有關，發生淋巴轉移的癌組織PD-L1陽性表達率明顯高于無淋巴轉移者（P＜0.05），見表2。

3 討論

圖1 結直腸癌患者PD-L1蛋白條帶圖

表2 結直腸癌患者基本特征與臨床病理特征（例）

隨著我國人民生活水平不斷提高，國民飲食結構發生了較大的變化，結直腸癌發生率逐年升高[8]。臨床上普遍運用腫瘤標志物CEA和CA199聯合檢測來診斷結直腸癌并進行預后判斷[9]。CEA的升高對診斷結直腸癌有著很大的參考價值，但缺乏較高的敏感度[10]，常導致診斷及治療最佳時期的錯失。近些年隨著對腫瘤免疫學研究的不斷發展，免疫逃逸機制的作用越來越為眾多研究者所重視。其中，CTL介導的T細胞免疫是人體抗腫瘤的主要細胞免疫之一。而協同刺激分子的缺失，將導致第二信號的缺如，從而導致腫瘤細胞逃避機體的免疫系統，不斷地增殖和擴散[11]。人體的程序性死亡分子PDL1基因位于染色體9q24，可通過與CD28超家族中的受體PD-1相結合，調節機體的免疫反應。

本研究通過基因水平及蛋白表達水平對50例結直腸癌患者進行觀察，結果顯示:在基因水平，結直腸癌組織中的PD-L1水平顯著高于癌旁組織，這一結果與SASIDHARAN等[7]的研究結果相一致。在蛋白質水平，PD-L1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率比癌旁正常組織高，且PD-L1在中低分化癌組織中的陽性率明顯高于高分化癌組織，相似的實驗結果在胃癌組織的PD-L1檢測中也有報道[12]。HUA等[13]研究表明33例結直腸癌患者中PD-L1的表達明顯高于正常組織。已有研究報道PD-L1在多種實體腫瘤組織中呈現表達上調，如乳腺癌[14]、腎癌[15]、肺癌[16]等。但國內外有關PD-L1的高表達現象與癌癥患者臨床病理特征的相關性尚未達成共識[17]。PD-L1/PD-1信號通路通過誘導T細胞凋亡或無能、促進免疫抑制因子的產生等機制削弱機體抗腫瘤免疫應答，促進腫瘤的免疫逃逸，與腫瘤的高侵襲性及不良預后相關[18]。本研究顯示PD-L1在腫瘤組織中的表達還與淋巴結轉移有關，有淋巴結轉移的患者PD-L1陽性率顯著高于無淋巴結轉移患者，我們推測PD-L1表達越強的患者，腫瘤轉移可能性越大，其預后越差。這也進一步表明PD-L1可能參與腫瘤免疫逃逸機制。LIN等[19]研究表明肺癌組織PD1、PD-L1陽性表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移及組織學分級有關。TOPALIAN等[20]研究發現腫瘤細胞表達的PD-L1過程中下調了腫瘤細胞和基質細胞微環境中浸潤型T細胞的數量，認為腫瘤細胞表達PD-L1在抵抗腫瘤的免疫反應過程中發揮著重要的作用。張占芳等[21]通過流式細胞學技術檢測75 例患者骨髓原始細胞中PD-L1的表達情況發現，PD-L1在白血病細胞中表達的總體陽性率為32%，表明PD-L1可能參與白血病細胞的免疫逃逸及原發耐藥機制，WANG等[22]通過對胰腺癌病例建立COX比例風險回歸模型分析發現PD-L1可作為胰腺癌患者預后評價的獨立指標。

綜上所述，本研究中結直腸癌組織中的PD-L1表達明顯高于癌旁組織，并且與腫瘤的分化程度及淋巴結轉移相關，表明其可能作為判斷結直腸癌患者病情進展及預后的依據之一，同時，也提示PD-L1在腫瘤的免疫逃逸中發揮一定作用。有文獻報道PD-1/PD-L1信號通路通過ITSM磷酸化從而調節細胞代謝、蛋白合成、增殖與凋亡的經典通路PI3K-AKTmTOR來參與免疫應答[23]。本課題組將會在后續的實驗中驗證PTEN-PI3K-Akt通路對PD-L1表達調控的具體機制。