高糖狀態通過升高缺氧誘導因子-1α促進胰腺癌的侵襲能力

秦濤 肖瑩 劉晗 黎韡 仵正 王錚 馬清涌 馬吉光

1西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科，西安 710061；2山東大學齊魯醫院肝膽外科，濟南 250012；3西安交通大學第一附屬醫院麻醉科，西安 710061

糖尿病與多種腫瘤的發生及發展密切相關[1-5]。實體腫瘤在發生、發展過程中局部微環境最顯著的變化是缺氧，腫瘤細胞也通過改變代謝方式和增加抗氧化應激能力等適應缺氧環境，因此缺氧與腫瘤的血管形成、腫瘤細胞的浸潤轉移、術后復發及化療耐藥等惡性進展密切相關[3]。研究表明，糖尿病是胰腺癌的危險因素同時也是胰腺癌的促進因素[6]，也有報道認為糖尿病是胰腺癌的早期臨床表現之一，血糖升高是胰腺癌所引起的后果[7]。胰腺癌處于缺氧微環境，這一狀態與其高侵襲特征密切相關[8]。另一方面，胰腺癌合并糖尿病因高糖狀態使血管內皮功能下降、血管內皮細胞損傷、毛細血管基底膜增厚等微循環系統結構改變，不僅造成胰腺組織內的灌流量下降，血供氧供減少，同時還引起氧氣彌散功能下降，進一步加重組織缺氧。缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是維持細胞和全身氧穩態的重要調節分子，缺氧條件下腫瘤通過HIF-1α調節糖代謝、血管形成、細胞增殖和組織重建，從而促進其細胞增殖、凋亡、血管生成、代謝和化療耐藥等作用[9]。本研究通過胰腺癌臨床病理資料分析及建立糖尿病裸鼠胰腺原位移植瘤模型，探討糖尿病狀態下胰腺內的高糖和缺氧微環境促進胰腺癌細胞侵襲能力的可能機制，對現有的糖尿病促進胰腺癌理論進行支持和補充。

資料與方法

一、研究對象

收集2012年1月至2014年12月間西安交通大學第一附屬醫院46例行胰腺癌手術切除患者臨床資料，其中男性25例，女性21例，年齡(54±12)歲。按照測得的空腹血糖水平分為血糖正常組(≥3.9 mmol/L～<6.1 mmol/L)28例和高血糖組(≥6.1 mmol/L)18例。記錄患者的腫瘤體積，有無膽管、血管侵犯，胰周脂肪組織浸潤程度，淋巴結轉移等情況。

二、胰腺癌組織HIF-1α表達檢測

采用常規免疫組織化學染色檢測胰腺癌組織的HIF-1α表達。HIF-1α一抗購自美國Abcam公司，工作濃度1∶100，二抗購自美國Pierce公司，工作濃度1∶1 000，最后DAB顯影，蘇木精復染，梯度乙醇脫水后中性樹脂封片，由病理科醫師顯微鏡下閱片。并使用Image J軟件中的IHC Profiler插件進行定量評分，強陽性(+++)為4分，陽性(++)為3分，弱陽性(+)為2分，陰性(-)為1分。HIF-1α陽性表達越高，則組織的缺氧狀態越嚴重。

三、糖尿病裸鼠胰腺原位移植瘤模型的構建

從上海斯萊克實驗動物有限責任公司購買20只4～6周齡的雌性裸鼠，體重20 g左右。普通飼養適應1周后將裸鼠隨機分為高血糖組和血糖正常組，每組10只。制模前禁食16 h，采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)200 mg/kg (即0.2 ml/10 g)的方法制備糖尿病模型。1周后測裸鼠血糖，以連續兩次血糖≥20 mmol/L且尿糖陽性為標準判斷糖尿病模型是否構建成功。

人胰腺癌細胞株BxPC3(中度分化)購于中科院上海細胞生物研究所，常規復蘇傳代。取107個對數生長期BxPC3細胞接種于正常裸鼠皮下，待皮下瘤形成后處死荷瘤鼠，皮膚消毒，取出腫瘤，剪成1 mm3的腫瘤組織塊，浸入生理鹽水中備用。腹腔注射4%水合氯醛溶液(0.01 ml/g)對上述高血糖組和血糖正常組裸鼠進行麻醉后，皮膚常規消毒，于左上腹部行1 cm的縱行切口，暴露胰腺，剪開胰腺被膜，將1 mm3的瘤塊植入胰腺實質內后縫合固定。6周后處死裸鼠，切取胰腺原位移植瘤，測腫瘤體積(V)[V(cm3)=1/2× 長(cm)×寬(cm)×寬(cm)]，并觀察腫瘤侵犯和轉移情況。

四、裸鼠原位移植瘤內缺氧狀態檢測

Hypoxyprobe-1是一種硝基咪唑類化合物，其化學成分是派諾咪唑，近年來被開發利用作為乏氧標志物，用于檢測組織的缺氧狀態，其原理是利用還原硝基有選擇性結合乏氧細胞的能力，從而形成的一種從細胞水平測定腫瘤乏氧的技術[10]。裸鼠處死前1 h，腹腔注射10 mg/ml的Hypoxyprobe-1液(6 μl/g)，處死裸鼠后獲取移植瘤標本，按Hypoxyprobe-1試劑盒(美國Hpi公司)說明書操作，即使用試劑盒中FITC耦聯的抗派諾咪唑的小鼠IgG單克隆抗體(FITC-MAb1抗體)孵育組織切片，通過搭配小鼠lgG-HRP二抗(美國Pierce公司)，運用免疫組織化學方法檢測Hypoxyprobe-1積聚區域面積來判斷移植瘤組織缺氧程度。

五、胰腺癌BxPC3細胞的分組

體外培養胰腺癌BxPC3細胞，分為常規培養組(對照組)、高糖培養組(高糖組)、缺氧培養組(缺氧組)、高糖+缺氧組以及靶向HIF-1α的siRNA轉染組(siRNA-HIF-1α組)、高糖+siRNA-HIF-1α組，陰性對照siRNA轉染組(siRNA-NC組)和高糖+siRNA-NC組。

高糖組細胞用含25 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養液培養，缺氧組細胞用150 μmol/L的二氯化鈷(CoCl2)干預(美國Sigma公司)，因為CoCl2中的二價鈷離子可通過競爭結合脯氨酸羥化酶(proline hydroxylase，PHD)中的二價鐵離子位點，抑制常氧狀態下 PHD 活性，可模擬缺氧狀態。

siRNA委托上海GenePharm公司設計與合成。siRNA-HIF-1α引物正向序列為5′-CCACCACUGAUGAAUUAAATT -3′，反向序列為5′-UUUAAUUCAUCAGUGGUGGTT-3′，siRNA-NC引物正向序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3′，反向序列為5′-ACGUGACAGGUUCGGAGAATT -3′。采用脂質體LipofectamineTM3000(美國Invitrogen公司)將siRNA-HIF-1α、siRNA-NC分別轉染BxPC3細胞，按照說明書操作，轉染后6 h更換新鮮培養液繼續培養。高糖+缺氧組及高糖+siRNA-HIF-1α組則將缺氧組或siRNA-HIF-1α組細胞換成用高糖培養液培養。

六、胰腺癌BxPC3細胞基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9, MMP-9)和HIF-1α表達檢測

收集各組對數生長期BxPC3細胞，采用RIPA裂解液(中輝赫彩公司)抽提細胞總蛋白，BCA法定量蛋白，調整濃度后常規行蛋白質免疫印跡法檢測蛋白表達，以β-actin作為內參。MMP-9、β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司，HIF-1α抗體購于美國Abcam公司，過氧化物酶標記山羊抗小鼠、抗兔二抗均購于美國Pierce公司。最后ECL發光，X線曝光、顯影、定影。采用凝膠圖像軟件分析系統掃描圖像，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

七、統計學處理

結 果

一、血糖正常組和高血糖組胰腺癌患者腫瘤侵襲轉移及瘤體體積比較

與血糖正常組比較，高血糖組胰腺癌患者的胰周脂肪組織浸潤率(66.7%比57.1%)、血管侵犯率(50%比42.9%)和淋巴結轉移率(27.8%比14.3%)均升高，但兩組差異無統計學意義(P值均>0.05)。高血糖組胰腺癌患者的腫瘤長徑[(2.95±0.73)cm 比(2.09±0.70)cm]和膽管侵襲率(22.2%比0)均顯著高于血糖正常組，差異有統計學意義(P值均<0.05)，提示高血糖能促進腫瘤的生長及侵襲能力。

二、血糖正常組和高血糖組胰腺癌患者腫瘤組織HIF-1α表達比較

46例胰腺癌組織均有HIF-1α的表達，其中+ 18例(39.1%)，++17例(47.0%)，+++ 11例(23.9%)。18例高血糖組患者癌組織HIF-1α + 5例(27.8%)，++ 5例(27.8%)，+++ 8例(44.4%)；28例血糖正常組患者癌組織HIF-1α+ 13例(46.4%)，++ 12例(42.9%)，+++ 3例(10.7%)，高血糖組患者胰腺癌組織HIF-1α強表達比例高于血糖正常組，兩組間HIF-1α的表達強度差異有統計學意義(Z=-2.104，P=0.035)，提示高血糖能上調HIF-1α表達，加重胰腺癌缺氧的程度。

三、裸鼠胰腺原位移植瘤的缺氧狀態及腫瘤的惡性行為

高血糖組裸鼠胰腺原位移植瘤的Hypoxyprobe-1積聚區域面積顯著大于血糖正常組(圖1)，差異有統計學意義[(43.2±2.4)%比(13.5±1.3)%，t=24.33，P<0.01]；原位移植瘤的體積[(1.82±0.88)cm3比(0.75±0.21) cm3，t=19.17]及發生肝轉移的比例(5/10比0/10)顯著高于血糖正常組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。高血糖組出現腹水的裸鼠只數多于血糖正常組(6/10比1/10)，但差異無統計學意義，提示高血糖能加重裸鼠胰腺移植瘤的缺氧狀態，促進腫瘤的生長及轉移。

圖1 血糖正常組(1)和高血糖組(2)裸鼠胰腺原位移植瘤的缺氧探針Hypoxyprobe-1(1A、1B)和HIF-1α(1C、1D)表達(×100)

四、各組胰腺癌BxPC3細胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達的變化

高糖組、缺氧組BxPC3細胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達水平均顯著高于對照組(t值分別為37.97、48.99，36.74、48.99)，高糖+缺氧組BxPC3細胞的MMP-9和HIF-1α蛋白表達水平又顯著高于其他3組(t值分別為80.56、56.55、49.57，44.15、20.91、13.17)，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖2，表1)。

圖2 對照組(1)、缺氧組(2)、高糖組(3)和高糖+缺氧組(4)BxPC3細胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達(蛋白質印跡法)

表1 各組胰腺癌BxPC3細胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達的比較

siRNA-HIF-1α組MMP-9和HIF-1α表達量顯著低于其他3組，高糖+siRNA-HIF-1α組MMP-9和HIF-1α的表達量顯著低于高糖+siRNA-NC組，差異均有統計學意義(P值均<0.05，表2，圖3)，提示抑制HIF-1α可下調MMP-9表達，而高糖可上調MMP-9和HIF-1α表達。

表2 各組胰腺癌BxPC3細胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達的比較

圖3 siRNA-NC組(1)、高糖+siRNA-NC組(2)、siRNA-HIF-1α組(3)和高糖+siRNA-HIF-1α組(4)BxPC3細胞MMP-9和HIF-1α蛋白表達 (蛋白質印跡法)

糖尿病是胰腺癌的危險因素，不僅可增加患者罹患胰腺癌的風險[6]，并且對已發生的胰腺癌具有明顯的促進作用[11]，胰腺癌患者的餐后血糖升高水平與其病死率呈劑量依賴性關系。最近一項前瞻性研究表明，患有糖尿病的患者罹患胰腺癌的風險是無糖尿病患者的兩倍，且血糖每增加1 mmol/L，胰腺癌的發病率升高15%[12]。對于可切除胰腺癌患者，如長期患有糖尿病，其病死率增加[13]。本課題組前期體外研究結果顯示，高糖微環境通過GDNF/RET及EGF/EGFR信號通路促進胰腺癌細胞的增殖[14-15]。本研究結果顯示，伴有糖尿病的胰腺癌患者出現胰周脂肪組織浸潤、血管侵犯以及胰周淋巴結轉移的例數、腫瘤生長速度、腫瘤膽管侵犯例數均大于血糖正常組，表明糖尿病可促進胰腺腫瘤的生長及增強其侵襲和轉移能力。

由于腫瘤生長過快等多種因素的影響，實體瘤普遍存在缺氧狀況。缺氧微環境是胰腺癌顯著特征之一，與腫瘤的進展、侵襲轉移及化療敏感性等密切相關[16]。HIF-1α是細胞對氧濃度變化的主要調節因子。缺氧條件下，HIF-1α穩定性增加，降解減少，在細胞中表達增加，并轉移到細胞核內與靶基因的缺氧反應原件結合，調節靶基因的轉錄[17]，從而影響腫瘤的發生和發展。研究表明，HIF-1α可以通過影響上皮間質轉變相關基因的表達來調控腫瘤的侵襲遷移過程。已有研究證實，高血糖可以誘導細胞缺氧和線粒體活性氧的生產[18]。本研究結果顯示，46例胰腺癌組織中均有HIF-1α的表達，且伴有高血糖的胰腺癌組織HIF-1α表達水平顯著高于血糖正常狀態下的胰腺癌。同樣在裸鼠胰腺癌原位移植瘤中，高糖組裸鼠的移植瘤組織內HIF-1α表達上調，缺氧狀況更加明顯，也表明高血糖可以促進裸鼠胰腺癌原位移植瘤的生長并增強其侵襲和轉移的能力。

MMP-9是基質金屬蛋白酶家族的成員之一，其在腫瘤中高表達與腫瘤的遷移侵襲有關。本研究體外實驗發現，高糖和缺氧都可以促使胰腺癌BxPC3細胞MMP-9和HIF-1α的表達水平上調，高糖和缺氧聯合干預時MMP-9和HIF-1α的表達水平更加顯著。采用RNA干擾技術沉默BxPC3細胞的HIF-1α基因表達后，高糖干預的BxPC3細胞的MMP-9表達水平降低。其原因可能是高糖狀態通過上調HIF-1α的表達來促進胰腺癌細胞侵襲能力，抑制HIF-1α基因的表達，可弱化高糖狀態對胰腺癌細胞侵襲能力的促進作用，但具體作用機制仍需進一步探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突