Cpf1核酸酶的原核表達、純化及多克隆抗體制備與鑒定

董 彬， 王 君， 孫 靜， 王報貴， 孫春龍， 吳 濤

(濱州學院 生物與環境工程學院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心， 濱州 256603)

CRISPR-Cas是近年來研究發現在古細菌和細菌中用來抵抗外部核酸入侵的一類獲得性免疫系統[1-2]。外部病毒首次侵入細菌，可使其DNA整合至宿主自身的CRISPR序列中，CRISPR序列轉錄后可以生成CRISPR RNA(crRNA)，當與crRNA配對的外部DNA片段再出現時，Cas核酸酶能夠切斷這些DNA，并為細菌提供免疫保護作用[3-5]。到目前為止，CRISPR系統可以分為3大類型[6]：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅰ型和Ⅲ型在進行DNA剪切時，需要多種Cas蛋白參與，而Ⅱ型系統僅需一個Cas蛋白發揮作用即可。CRISPR/Cas9是第1個成功應用在基因編輯上的Ⅱ型CRISPR/Cas系統[7]。CRISPR/Cas9由一段帶有與目的基因序列相同的guideRNA指引Cas9蛋白到達指定位置發揮作用，導致DNA雙鏈破壞(Double strand break, DSB)，利用生物體本身具有的非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)自身修復機制，在修復時引起堿基改變達到基因編輯的目的[8-9]。現已證實，CRISPR/Cas9可以在酵母菌、哺乳動物細胞、小鼠、果蠅、斑馬魚、擬南芥、水稻等多個物種中發揮基因編輯作用[9-17]。

CRISPR/Cpf1是2015年新發現的一種Ⅱ型系統[18]，與CRISPR/Cas9相比，CRISPR/Cpf1系統具有許多優點[19-20]：1)只需一個協助RNA分子，Cas9需要2個RNA分子協助；2)Cpf1蛋白分子量相比Cas9蛋白較小，易于進入目標宿主；3)CRISPR/Cpf1具有獨特的識別位點序列，能使脫靶率降低；4)剪切位置與Cas9不同，選擇余地更大;5)產生黏性末端，便于新DNA序列插入。利用 CRISPR/Cpf1 進行操作的基本條件是：1)研究對象能高效表達Cpf1蛋白這一核酸切割“剪刀”；2)靶基因的原型間隔序列毗鄰基序 PAM(Protospacer-adjacent motif)為 NGG，只要目的基因滿足這一基本條件，就有可能利用這一系統對靶基因進行定點遺傳操作。……