氣相色譜法測定中藥酊劑甲醇量的測量不確定度評定

陳恒沖 馬彬峽 李思詩 趙 翙

1.本溪市藥品檢驗所，遼寧本溪 117000；2.本溪市衛生學校，遼寧本溪 117000

測量不確定度是與測量結果相關聯的參數，它表征了可以合理地賦予被測量量值分散性的非負參數[1-2]，可有效提高檢驗結論的準確性和科學性[3-5]。2015年版《中國藥品檢驗標準操作規范》介紹了pH值測定法、非水溶液滴定法等4個檢驗方法的不確定度評定實例[6]，測量結果不確定度評定與表示將我國藥品檢驗領域全面應用[7-13]。

中藥酊劑是將原料藥物用乙醇提取或溶解制成的液體制劑，應按照《中華人民共和國藥典》四部通則（0871）甲醇量檢查法進行限度檢查[14]。本研究以中藥酊劑正骨水甲醇量測定法為例，細化評估不確定度分量，建立了甲醇量檢查氣相填充柱測定法的不確定評定方法，對其他采用內標法的測定方法具有參考意義。

1 測定方法及不確定度來源分析

1.1 儀器與試藥

Agilent7890A型氣相色譜儀（美國安捷倫）；正骨水（廣西玉林制藥集團有限責任公司，批號：1811362）；無水甲醇（色譜純，含量＞ 99.9%），正丙醇為色譜純，水為一級純化水。

1.2 色譜條件

色譜柱：不銹鋼填充柱（4m×1/8，填料：二乙烯苯-乙基乙烯苯型高分子微球80～100目）；柱溫：125℃；進樣口溫度：150℃；檢測器（FID）溫度：160℃；載氣：N2，流速：25mL/min；H2流速：60mL/min；空氣流速：400mL/min。理論板數按甲醇峰計算應不低于1500，甲醇、乙醇和內標物質各相鄰色譜峰之間的分離度應大于1.5。

1.3 測量流程及結果計算模型

按照標準規定分別配制對照品溶液與供試品溶液，并在上述條件下測定。具體測量流程見圖1。

根據測定原理和過程，甲醇量可按以下公式計算：

CX為供試品中的甲醇量（%）；AX為供試品溶液的峰面積；A'S為供試品溶液中內標物正丙醇的峰面積；DX為供試品的稀釋倍數；D'S為供試品溶液中內標物的稀釋倍數；f為內標法校正因子。校正因子（f）按下式計算：

圖1 甲醇量測定流程圖

AS為內標物的峰面積；AR對照品溶液的峰面積；DS為內標物的稀釋倍數；DR為對照品無水甲醇的稀釋倍數；PR為對照品無水甲醇的純度。

1.4 不確定度來源分析

從檢測過程和數學模型分析，甲醇量測定的不確定度來源，主要有對照品溶液和供試品溶液的配制過程，進樣量誤差和重復性，峰面積積分，對照品純度等。

根據內標法測定原理和配制過程分析，將甲醇峰與內標物正丙醇峰的峰面積比值（As/AR）作為一個輸入量進行分析，可以同時涵蓋進樣重復性、積分重復性、檢測器響應帶來的不確定度，并且抵消進樣體積誤差。綜上，整理內標法測定中藥酊劑中甲醇量的測量不確定度因果關系見圖2。

圖2 內標法測定中藥酊劑中甲醇量的測量不確定度來源

量瓶②為對照品與內標物的混合容器，量瓶③為供試品與內標物的混合容器，這兩只量瓶校準與重復性引起的容量誤差在內標法測定中可以抵消。在同一環境溫度配制對照品溶液和供試品溶液，稀釋溶劑受溫度影響的膨脹變化也基本可以抵消，因供試品正骨水的膨脹系數無法提供，故供試品受溫度的影響本例也不予考慮，但甲醇受溫度影響的膨脹稀釋較大，精密量取1mL無水甲醇對照品，仍需考慮溫度影響。

2 各不確定度分量的分析與量化

2.1 對照品溶液校正因子f的不確定度評定

2.1.1 正丙醇峰與甲醇峰的峰面積比值（As/AR） 對照品溶液連續進樣5次，As/AR分別為1.52、1.53、按貝塞爾公式計算

相對標準不確定度為

2.1.2 對照品純度（PR） 對照品無水甲醇的含量＞99.9%，按矩形分布計算，取包含因子，則相對標準不確定度為：

2.1.3 對照品稀釋定容（DR）的有效不確定度 （1）校準：對照品無水甲醇稀釋定容使用的玻璃量器，根據計量檢定規程規定[15]，容量允差分別為1mL移液管±0.008mL；10mL移液管 ±0.05mL；100mL量瓶±0.10mL，忽略100mL量瓶②，按三角分布，取包含因子，則有效相對標準不確定度為:

（2）重復性：按照本實驗室玻璃量器檢定的數據統計，定容體積重復性標準偏差分別為1mL移液管 SDy（1mL）=0.0014mL；10mL 移液管 SDy（10mL）=0.000 81mL；100mL 量瓶 SDl（100mL）=0.000 62mL，忽略100mL量瓶②，則有效相對標準不確定度為:

（3）溫度：本例僅考慮精密量取無水甲醇1mL受環境溫度影響引入的不確定度，設室溫為（20±5）℃。液體的體積膨脹明顯大于玻璃量器的體積膨脹，因此只需考慮液體體積膨脹。甲醇的體積膨脹系數為1.2×10-3mL/min，按矩形分布，取包含因子，環境溫度引入的有效相對標準不確定度為：

2.1.4 對照品溶液內標物稀釋定容（DS）的有效不確定度

內標物正丙醇稀釋定容使用的玻璃量器與對照品相同，則其校準有效相對標準不確定度為:

重復性有效相對標準不確定度為：

綜上，合成校正因子f的有效相對不確定度為:

2.3 供試品溶液內標物稀釋定容（）的有效不確定度

（1）校準：供試品溶液內標物稀釋定容使用的玻璃量器，根據計量檢定規程規定，容量允差分別為1mL移液管±0.008mL；100mL量瓶±0.10mL，忽略10mL量瓶③，按三角分布，取包含因子則有效相對標準不確定度為:

（2）重復性：按照本實驗室玻璃量器檢定的數據統計，定容體積重復性標準偏差分別為1mL移液管SDy（1mL）=0.0014mL；100mL量瓶SDl（100mL）=0.000 62mL，忽略10mL量瓶③，則有效相對標準不確定度為:

合成供試品溶液內標物稀釋定容的有效相對不確定度為:

2.4 供試品稀釋定容（DX）的有效不確定度

因為10mL量瓶③定容至刻度的誤差可以抵消，故本例只考慮供試品取樣量（Vx）的有效不確定度，供試品取樣量（Vx）為10mL量瓶③與1mL移液管的體積差。10mL量瓶容量允差為±0.020mL，其校準標準不確定度為:

定容重復性標準偏差為SDl（10mL）=0.000 53mL，其重復性標準不確定度為:

1mL移液管容量允差為±0.008mL，其校準標準不確定度為:

定容重復性標準偏差為：SDy（1mL）=0.0014mL，其重復性標準不確定度為:

則供試品取樣量（Vx）的有效標準不確定度為:

因為取樣量為9mL，則有效相對標準不確定度為：

3 合成標準不確定度

合成相對標準不確定度為

實驗中測得甲醇量為0.023%，則合成標準不確定度為:

4 擴展不確定度與報告

實驗結果一般用擴展不確定度表示，取包含因子k=2（ 置信概率約95%），則甲醇量測定結果的擴展不確定度為:

本例正骨水中甲醇量的測定結果可表示為：0.023%±0.000 78%（k=2）。

5 討論

通過上述各不確定度分量的對比可以發現，供試品溶液甲醇峰與正丙醇峰面積比值重復性的相對標準不確定度最大，在對照品溶液校正因子不確定度的各分量中，也是甲醇峰與正丙醇峰面積比值重復性的相對標準不確定度最大，說明本法測定結果主要受氣相色譜儀的準確性和穩定性影響。其次，是對照品溶液與供試品溶液稀釋定容過程的影響，應注意所用玻璃量器懂的準確度均符合A級標準，配制過程在溫度穩定的環境中同時進行，檢測人員操作應規范一致。

在藥品檢測過程中，通常使用的將計算公式作為測量模型劃分不確定度分量的方式，本研究詳細分析了影響填充柱GC法測定甲醇量的所有因素，舍棄了本法及內標法使用時可以抵消的部分影響因素，建立了較為完整的不確定度評價方法，對其他藥物制劑及方法的不確定度評定提供了有益的參考。但不同的檢測品種及項目，測定過程會有區別，應結合實際，全面考慮不確定度來源，合理設計方法確認試驗。