調(diào)節(jié)性B細胞對免疫性血小板減少癥模型小鼠的治療效果

劉 云 孫靜芳 李朋朋 馬 萍

徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 221002

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種后天獲得的自身免疫出血性疾病，其病因尚未完全明確，ITP患者主要表現(xiàn)為血小板數(shù)量減少、骨髓巨核細胞數(shù)正常或增多伴成熟障礙、產(chǎn)板不良。目前研究表明，ITP發(fā)病是由細胞免疫和體液免疫共同參與的免疫功能異常[1-2]。有小樣本臨床試驗證明，ITP患者存在調(diào)節(jié)性B細胞（regulatory B cell，Breg）數(shù)量的降低，其發(fā)揮作用可能與分泌白細胞介素-10（IL-10）調(diào)節(jié)th1/th2的平衡及參與誘導效應T細胞的凋亡有關(guān)[3-4]。本實驗通過對ITP疾病模型小鼠注射經(jīng)流式分選的Breg細胞，探究Breg細胞對該疾病的治療效果，以期為臨床ITP治療提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗所用Balb/c小鼠購于南京大學模式動物研究所，小鼠均為8～10周齡的SPF級鼠，共需60只，并飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學IVC系統(tǒng)。

1.2 儀器與試劑

抗鼠CD4-FITC、CD5-APC、CD19-FITC、CD25-PE、CD1d-PE、Foxp3-APC抗體均購于美國BD公司；FACS Calibur流式細胞儀購于美國BD公司；淋巴細胞分離液購于天津市灝洋生物制品有限責任公司；血細胞計數(shù)儀購于邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 磨脾制備小鼠Breg細胞 脫頸處死小鼠后放至碘仿中浸泡5min，在超凈臺內(nèi)無菌的條件下分離小鼠脾臟，取好的脾臟暫時放入冰的PBS中，隨后放置于200目濾網(wǎng)上研磨，邊研磨邊加小鼠淋巴細胞分離液，將細胞沖下，收集細胞到離心管中，覆蓋一層PBS，800g 4℃離心25min。脾細胞計數(shù)后按照0.25μg/106加入CD16/CD32，孵育15min，加入CD19抗體，每2×107加 1μL抗體，冰上避光孵育15min，將渦旋后磁珠加入PBS洗滌過的細胞，冰上避光孵育30min。將處理好的細胞加入BD管，過柱子，重復多次后收集細胞，計數(shù)后按照流式抗體說明書加入所需抗體CD5-APC、CD19-FITC、CD1d-PE，避光孵育 30min，上機分選，得率為1.5%，共得到1.37×107個Breg細胞。

1.3.2 ITP小鼠模型的建立 將12只小鼠隨機分為兩組，即正常對照組（N組）和ITP模型組（I組），模型組小鼠根據(jù)體重腹腔注射CD41a抗體，每20克體重小鼠注射100μg藥物，每隔2h割取小鼠尾靜脈取血進行血常規(guī)檢測，記錄血小板的變化。

1.3.3 實驗分組 將24只小鼠隨機平均分為兩組，即ITP模型組（I組）和ITP+Breg輸注組（IB組），I組小鼠腹腔注射CD41抗體，IB組小鼠在腹腔注射CD41抗體后經(jīng)尾靜脈輸注1×106個Breg細胞。

1.4 觀察指標

每隔一定時間經(jīng)尾靜脈取血進行血常規(guī)檢測，在I組與IB組血小板下降百分比比較差異有統(tǒng)計學意義的時間點以及觀察終點取小鼠脾臟進行調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）和Breg的流式檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP模型的建立

根據(jù)小鼠體重腹腔注射CD41a抗體，5～12h血小板下降至最低，隨后開始升高，2d后恢復正常，提示造模成功，見圖1。

2.2 兩組小鼠不同時間點血小板計數(shù)的變化情況比較

經(jīng)尾靜脈取血檢測兩組小鼠的血常規(guī)，統(tǒng)計血小板計數(shù)顯示，在第5、42、68小時I組與IB組小鼠血小板計數(shù)下降百分比比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表 1。

表1 兩組小鼠不同時間點血小板計數(shù)的變化情況比較（±s，×109/L）

表1 兩組小鼠不同時間點血小板計數(shù)的變化情況比較（±s，×109/L）

注：兩組同時間點比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 5h 7h 9h 13h 18h 30h I組 12 43.63±9.37 64.72±10.80 65.98±15.59 75.55±6.88 80.74±5.55 77.55±5.03 IB組 12 76.13±6.16 75.13±2.38 78.55±2.46 81.37±3.71 84.11±4.31 81.50±5.40 t 5.799 1.883 1.876 1.642 1.267 1.419 P 0.001** 0.109 0.111 0.145 0.229 0.181組別 n 36h 42h 55h 60h 68h I組 12 76.88±3.14 66.80±4.59 58.77±6.63 49.61±6.60 29.07±1.82 IB組 12 76.66±8.52 81.15±4.47 56.73±6.50 56.79±9.72 40.92±1.68 t 0.049 3.880 0.357 1.223 8.283 P 0.962 0.018* 0.739 0.267 0.001**

圖1 ITP模型的建立：血小板計數(shù)隨時間的變化

2.3 流式分析

在第5、42、68小時3個時間點，每組各取4只小鼠進行麻醉后并處死，在操作臺上取脾臟磨脾來收集細胞進行流式檢測。經(jīng)過流式分析發(fā)現(xiàn)，I組小鼠的Treg細胞的變化為升高趨勢，而IB組小鼠表現(xiàn)為先下降后又升高的趨勢，第42、68小時兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2A-B）；I組在這3個時間點的Breg細胞百分比變化不大，IB組則表現(xiàn)為先升高后下降，第42小時兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2C-D），見表2。

表2 兩組小鼠不同時間點Treg細胞與Breg細胞變化情況比較（±s，%）

表2 兩組小鼠不同時間點Treg細胞與Breg細胞變化情況比較（±s，%）

組別 n 5h 42h 68h I組 4 Treg 2.50±0.53 3.27±0.86 3.23±0.24 Breg 1.97±1.12 1.78±0.22 1.90±0.62 IB組 4 Treg 2.13±0.21 1.90±0.08 2.30±0.10 Breg 3.00±0.99 4.33±1.30 1.55±0.48 t兩組Treg比較 1.117 3.260 4.010 P兩組Treg比較 0.327 0.022 0.009 t兩組Breg比較 1.047 3.984 0.845 P兩組Breg比較 0.372 0.010 0.437

圖2A-B I組與IB組小鼠Treg百分比的變化情況

圖2C-D I組與IB組小鼠Breg百分比的變化情況

3 討論

ITP是一組以血小板減少伴或不伴皮膚黏膜出血為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，現(xiàn)有研究結(jié)果指出，其是由體液免疫和細胞免疫共同介導而導致血小板過度破壞與生成受到抑制，并有氧化應激狀態(tài)。Treg細胞是T細胞亞群的一種，能夠分泌IL-4、IL-10和TGF-β，可以誘導免疫耐受和參與維持免疫穩(wěn)態(tài)，通常與Th17相互制衡，在自身免疫性疾病的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮作用[5-6]。目前的報道傾向于Treg功能紊亂導致了ITP免疫耐受性的缺失，一個基于30例ITP患者的研究表明，Treg數(shù)量的減少程度與疾病嚴重程度相關(guān)[7]。Breg是指一種B細胞亞群，通過分泌IL-10、IL-35、TGF-β等發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用，參與免疫耐受和炎癥反應，目前對Breg的研究多集中在自身免疫性疾病以及抗腫瘤免疫應答中[8]。Breg可以通過分泌IL-10發(fā)揮效應，IL-10抑制CD4+T細胞的增殖和CD4+T細胞產(chǎn)生干擾素γ（interferonγ，IFNγ），抑制Th17和Th1的分化，同時誘導Th0細胞（Naive T細胞）向Th2細胞分化，從而影響Th1/Th2的平衡；此外，IL-10抑制抗原呈遞細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的活化，并抑制這些細胞分泌促炎性細胞因子，與此同時有較多研究表明，Breg通過IL-10分泌在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化和其他免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著負免疫調(diào)節(jié)作用[9-12]。在ITP發(fā)病機制的有關(guān)研究表明，Breg可通過分泌IL-10以及TGF-β抑制反應性T細胞的活性和B細胞抗體的產(chǎn)生，促進Treg的分化與增殖而介導機體免疫耐受，Breg功能的失調(diào)和數(shù)量的下降與疾病的發(fā)生相關(guān)[13-16]。

本研究中選擇CD19+CD5+CD1dhi作為Breg的分選標記，經(jīng)尾靜脈輸注給ITP模型小鼠，以期達到緩解病情的目的。流式結(jié)果顯示，I組小鼠的Treg細胞的變化為升高趨勢，而IB組小鼠表現(xiàn)為先下降后又升高的趨勢，第42、68小時兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；I組在這3個時間點Breg細胞變化不大，IB組則表現(xiàn)為明顯的先升高后下降，第42小時兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。綜合分析本實驗結(jié)果與已發(fā)表臨床試驗結(jié)果并不符合，可能的原因分析如下，細胞免疫與體液免疫是一個長期的效應，在本實驗的觀察內(nèi)還未看到效果，同時ITP模型持續(xù)時間短，此種建模方式不適用于免疫學的研究，另外目前對于Breg亞型的定義不同，也可導致研究結(jié)果與臨床研究不符。

4 結(jié)論

為完善研究，下一步需建立慢性ITP小鼠疾病模型，增加實驗小鼠數(shù)量，繼續(xù)開展Breg治療效果的研究，期望為進一步了解ITP發(fā)病機制及臨床治療提供新思路。